Nhiều phương pháp phân lập khác nhau đã được mô tả để có thể thu được một tập hợp chứa MSC từ hỗn hợp ban đầu là các tế bào của tủy xương người. Hiện nay phương pháp phân lập MSC thường dựa trên các nguyên lý là sự kết
hợp đa dạng các đặc tính của MSC: i) khả năng bám dính, ii) các đặc điểm nhân và bào tương, iii) các marker bề mặt âm tính hoặc dương tính.
1.3.1.1. Dựa vào khả năng bám dính của tế bào gốc trung mô
Cơ sở: MSC có các phân tử bám dính trên bề mặt tế bào, do vậy trong điều kiện nuôi cấy ngoài cơ thể, các tế bào này có khả năng bám đơn lớp vào bề mặt nhựa nuôi cấy và có hình dạng giống nguyên bào sợi [38]. Trong khi đó, HSC trong tủy xương không có khả năng bám dính này, sẽ bị loại bỏ dần khi thay mới môi trường.
Phương pháp phân lập dựa vào khả năng bám dính của MSC là phương pháp được Friedenstein và cs mô tả [44], nhờ đó tác giả phát hiện trong tủy xương chuột một loại tế bào có khả năng bám dính, không thuộc dòng tế bào máu và có khả năng biệt hóa thành tạo cốt bào. Hiện nay khả năng bám dính vẫn được dùng để phân lập MSC. Phương pháp này còn được áp dụng có hiệu quả đối với phân lập MSC có nguồn gốc từ các mô rắn như thành mạch máu, thành dây rốn....và trở thành một trong những tiêu chuẩn bắt buộc để xác định tập hợp tế bào là MSC sau khi phân lập từ một mô nào đó trong cơ thể [38].
Ngoài ưu điểm là không đòi hỏi nhiều loại trang thiết bị, hạn chế của phương pháp là hiệu quả nuôi cấy sơ cấp MSC từ tủy xương thấp do trong tủy xương chiếm chủ yếu là các tế bào thuộc dòng máu ở nhiều giai đoạn biệt hóa khác nhau.
1.3.1.2. Dựa vào tỷ trọng của tế bào – Kỹ thuật ly tâm theo gradient tỷ trọng
Nguyên lý: Tạo lớp dung dịch tỷ trọng khác biệt với tỷ trọng của loại tế bào cần tách. Trong hỗn hợp tế bào của dịch tủy xương, MSC thuộc loại tế bào đơn nhân, có tỷ trọng tương đương với tế bào lympho và bạch cầu mono. Các tế bào đơn nhân có tỷ trọng thấp hơn hồng cầu và bạch cầu hạt. Một hệ gradient tỷ trọng được tạo ra bằng cách sử dụng một dung dịch có tỷ trọng cao hơn tỷ trọng của MSC nhưng thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt. Cho dung dịch tỷ trọng này vào ống ly tâm, nhỏ hỗn dịch tế bào của tủy xương (được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy) lên phía trên sao cho tạo được diện tiếp xúc phân biệt
giữa hai lớp. Sau khi ly tâm, tập hợp tế bào đơn nhân có chứa MSC tạo thành một lớp tế bào “vòng nhẫn”, nằm sát trên lớp dung dịch tỷ trọng. Hồng cầu và bạch cầu hạt nằm ở đáy ống, phía dưới của lớp dung dịch tỷ trọng.
- Các loại dung dịch tỷ trọng: Trong phân lập MSC cũng như tế bào đơn nhân tủy xương, người ta thường sử dụng dung dịch có tỷ trọng 1,073 g/ml hoặc 1,077 g/ml, ví dụ:
* Các sản phẩm Ficoll: Ficoll là dung dịch chứa các hạt polysaccharid (sucrose) trọng lượng phân tử cao và natri diatrizoate trung tính, kị nước, kích thước hạt từ 2 ÷ 7 nm. Histopaque - 1077 và Ficoll – uromiro là các loại dung dịch Ficoll có tỷ trọng 1,077 g/ml.
* Các sản phẩm Percoll: Percoll là dung dịch chứa các hạt colloidal silica, đường kính 15 ÷ 30 mm (23% w/w trong nước), được bao phủ bởi polyvinylpyrrolidon. Percoll được dùng trong phân tách các tế bào, bào quan, virut bằng ly tâm tỷ trọng do có độ nhớt thấp, độ thẩm thấu (osmolarity) thấp, không gây độc cho tế bào và các thành phần của tế bào.
Kỹ thuật ly tâm gradient theo tỷ trọng thu hoạch các tế bào đơn nhân tủy
xương là kỹ thuật được áp dụng phổ biến trong các nghiên cứu phân lập MSC in
vivo và in vitro, với ưu điểm là dễ tiến hành và mang lại hiệu quả phân lập cao. Kỹ thuật này có thể phối hợp với các kỹ thuật khác nhằm tăng cường hiệu quả và chất lượng phân lập MSC từ nhiều loại dịch cơ thể khác nhau: dịch hút mỡ, dịch hút tủy xương, máu tuần hoàn, dịch ối.
1.3.1.3. Dựa vào các kháng nguyên bề mặt
Cơ sở: MSC đã được xác định biểu hiện một số marker bề mặt đặc trưng [38], tuy nhiên đây là sự mô tả tập hợp MSC sau khi đã phân lập và nuôi cấy. Một số marker khác hiện đã được sử dụng để chọn lựa trực tiếp từ tủy xương để có được một tập hợp tế bào có khả năng tăng sinh mạnh và có các đặc điểm của MSC, bao gồm: Stro – 1, CD49a, CD146, CD271 [103]. Việc sử dụng các marker bề mặt thông qua phản ứng miễn dịch để chọn lọc âm tính hoặc dương tính. Quá trình chọn lọc tế bào sau đó được thực hiện trên các thiết bị chuyên
dụng như: thiết bị đếm tế bào dòng chảy (Flow cytometer) – phương pháp FACS (Fluorescence-activated cell sorting) hoặc cột từ trường – phương pháp MACS (Magnetic-activated cell sorting).