1.4.4.1. Các thử nghiệm liệu pháp tế bào gốc của tủy xương
Theo thống kê của Wei và cs [130], hầu hết các thử nghiệm lâm sàng đã
hoàn tất đều được tiến hành trên các bệnh nhân NMCT cấp có ST chênh (ST- elevation MI - STEMI), từ 18 ÷ 75 tuổi, đã thông mạch vành thủ phạm thành công và đặt stent. Hầu hết các bệnh nhân đều có phân số tống máu thất trái từ 30% đến 45% (bình thường từ 50% ÷ 70%). Ở những nghiên cứu thực hiện theo phương pháp “mù đôi”, bệnh nhân được phân chia ngẫu nhiên vào nhóm sử dụng liệu pháp tế bào và nhóm chứng (hầu hết nhóm chứng sử dụng thuốc trấn an – Placebo control). Một số liệu pháp áp dụng trên đối tượng bệnh nhân suy tim mạn tính. Các liệu pháp này sử dụng tế bào gốc tủy xương tự thân được tiến hành theo hai phương thức chính:
(1) Phương thức huy động các tế bào gốc từ tủy xương ra máu ngoại vi các tế bào CD 34(+), bằng yếu tố kích thích tạo cụm bạch cầu hạt (Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF) ngay sau NMCT khoảng 5 ÷ 6 ngày.
(2) Phương thức cấy ghép các tế bào tự thân nguồn gốc tủy xương, bằng cách truyền vào động mạch vành (theo con đường của kỹ thuật thông mạch vành), được tiến hành trong vòng 1 tuần sau NMCT.
Một số thử nghiệm quy mô nhỏ tiến hành cấy ghép bằng cách tiêm trực tiếp vào cơ tim (tiêm từ ngoài vào vùng rìa của mô cơ tim bị tổn thương trong khi thực hiện kỹ thuật bắc cầu động mạch vành (coronary artery bypass grafting - CABG). Ngoài ra, có thể thực hiện tiêm tế bào vào cơ tim từ trong ra qua hệ thống catheter. Tủy xương của bệnh nhân sau khi được hút ra, ly tâm gradient tỷ trọng, tách tập hợp tế bào đơn nhân không chọn lọc. Tập hợp tế bào này được sử
dụng trực tiếp trong hầu hết các thử nghiệm sử dụng cấy ghép tế bào tủy xương. Một số thử nghiệm khác sử dụng cấy ghép một tập hợp tế bào con từ tập hợp tế bào đơn nhân tủy xương trên (ví dụ CD 133+ hoặc CD 34+), nhờ chọn lọc tế bào bằng huỳnh quang (fluorescence-activated cell sorting – FACS). Các phân tích điểm cuối được tiến hành sau cấy ghép tế bào từ 1 đến 18 tháng. Những cải thiện về khả năng co bóp của tim như: tăng phân số tống máu thất trái (left ventricular ejection fraction - LVEF), giảm thể tích cuối tâm thu (end-systolic volume) và giảm hiện tượng tái cấu trúc có hại cho buồng thất trái (left ventricle negative remodelling) như: giảm diện tích ổ nhồi máu, tăng độ linh hoạt của thành cơ tim vùng bị nhồi máu, tăng tưới máu và làm mỏng đi thành tâm thất, được xác định bằng hình ảnh cộng hưởng từ, bằng các kỹ thuật SPECT (single photon emission computed tomography), PET (positron emission tomography) và siêu âm tim.
Ở Việt Nam, lần đầu tiên một thử nghiệm lâm sàng liệu pháp tế bào gốc tủy xương trong điều trị tim mạch được thực hiện tại Viện Tim mạch Quốc gia [4],[6]. Thử nghiệm này sử dụng tế bào gốc tủy xương tự thân để điều trị cho 6 bệnh nhân suy tim nặng sau nhồi máu cơ tim, tuổi từ 43 ÷ 67, sau khi đã được điều trị tim mạch can thiệp như nong hoặc đặt stent. Kết quả bước đầu cho thấy chức năng co bóp của tim bệnh nhân đã cải thiện so với trước khi truyền tế bào gốc (tăng phân số tống máu thất trái).
1.4.4.2. Các thử nghiệm liệu pháp tế bào gốc trung mô
Theo thống kê của Ankrum [8], hiện đã có gần 1000 bệnh nhân tim mạch sử dụng liệu pháp MSC, thuộc các loại bệnh: bệnh cơ tim phì đại, cơ tim thiếu máu cục bộ, suy tim, NMCT và bệnh hệ thống mạch máu ngoại vi. Số lượng các thử nghiệm sử dụng MSC tự thân (autogenetic) tương đương với các thử nghiệm sử dụng MSC “cho – nhận” (allogenetic). Tác dụng của cấy ghép MSC đối với bệnh tim mạch nghiêng về giả thuyết: MSC có khả năng phục hồi nuôi dưỡng mô hơn là MSC có khả năng biệt hóa để tạo thành tế bào cơ tim chức năng, với tỷ lệ tương ứng lần lượt là 16/3 trường hợp. Khác với liệu pháp tế bào gốc tủy
xương, liệu pháp MSC thường sử dụng tiêm trực tiếp vào vùng tổn thương, một số ít thử nghiệm truyền tế bào vào động mạch hoặc tĩnh mạch vành.
Bảng 1.4. Thống kê các thử nghiệm lâm sàng tế bào gốc trung mô trên các bệnh nhân tim mạch [8] Loại bệnh tim mạch Số ca/ Số bệnh nhân MSC cho- nhận MSC tự thân Tác dụng Đƣờng đƣa tế bào Nuôi dƣỡng Biệt hóa Tĩnh mạch Tại chỗ /Cơ tim Động mạch
Cơ tim phì đại 2 (8) 2 2 2
Suy tim 3 (200) 2 1 2 1 3
Thiếu máu
cục bộ cơ tim 3 (160) 3 2 1 3
NMCT 7 (428) 4 3 6 1 3 4
Thiếu máu chi 4 (83) 3 1 4 3 1
CHƢƠNG II
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ CHẤT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Tế bào gốc trung mô được phân lập từ tủy xương người.
2.1.2. Chất liệu nghiên cứu
Tủy xương vùng xương chậu của người.
- Tiêu chuẩn tuyển chọn người cho tủy:
Nguồn tủy xương của bệnh nhân tình nguyện.
Các bệnh nhân này được lấy tủy xương (khoảng 300 ml) để tách tế bào gốc,
điều trị các bệnh về xương tại Bệnh viện Việt – Đức, với sự hỗ trợ của Bệnh viện TW Quân đội 108 (bệnh nhân tự nguyện điều trị). Đề tài sẽ được nhận 1 ÷ 2ml dịch tủy xương.
Bệnh nhân có chỉ định làm xét nghiệm tủy đồ tại khoa Huyết học Bệnh viện
Bạch Mai. Khi có kết quả xét nghiệm bình thường, đề tài sẽ được cho lượng tủy xương còn lại, khoảng 1 ml.
Không giới hạn về tuổi tác giới tính.
- Tiêu chuẩn loại trừ người cho tủy:
Tuỷ xương của các bệnh nhân có các bệnh ác tính về cơ quan tạo máu.
- Tổng số mẫu tủy là 20 mẫu.
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2.2.1. Dụng cụ 2.2.1. Dụng cụ
- Chai nuôi cấy 25 cm2 và giếng nuôi cấy (Nunc)
- Phiến nhựa nuôi cấy di động, đường kính 2cm (Invitrogen)
- Bơm tiêm các loại và kim vô trùng (Việt Nam)
2.2.2. Trang thiết bị
- Cabin vô khuẩn: Biological Safety Cabinets Class II (NUAIRE)
- Máy ly tâm: (Kubota 5922, Nhật Bản)
- Máy luân nhiệt PCR: (Gene AmpPCR System 9700)
- Máy chụp gel: (Dolphin- Chemi – Wealtec)
- Bộ điện di: Mupid (Nhật Bản)
- Máy PCR định lượng: (Lightcyber –Roche)
- Kính hiển vi (KHV) quang học (Nikon eclipse E600)
- KHV quang học đối pha.
- KHV điện tử truyền qua: JEM 1010 (JEOL - Nhật Bản)
- Thiết bị đếm tế bào dòng chảy: FC500 BECKMAN COUNTER
- Tủ lạnh - 200C, - 800C (Nhật Bản)
2.2.3. Hóa chất, thuốc thử
Để phân lập tế bào đơn nhân từ tủy xương
- Human mesenchymal cell enrichment cocktail (RosetteSep)
- Histopaque - 1077 (Sigma – Aldrich)
Để nuôi cấy và biệt hóa tế bào
- DMEM – LG (Dullbecco’s modifies Eagle’s medium - low glucose)
(Invitrogen)
- FBS (Fetal bovine serum) (Invitrogen)
- Streptomycine 10 000 UI/ml– Penicilline 10 000 g/ml (Invitrogen)
- Trypsin – EDTA 0,25% (Invitrogen)
- PBS (Phosphat buffer saline) (Invitrogen)
- MCDB – 201, insulin bò, transferin người, sodium selenite, albumin huyết
thanh bò, linoleic acid, ascorbat phosphat, dexamethason (Sigma)
- 5 - azacytidin (Sigma)
Các kháng thể đơn dòng
- Kháng thể kháng CD34, kháng thể kháng CD45 (Dako)
- Kháng thể kháng CD13 gắn PE, kháng thể kháng CD45ECD, kháng thể kháng
CD34 PE (Beckman Counter)
- Kháng thể kháng CD73 PE, kháng thể kháng CD 90 FITC (B&D)
- Mouse IgG PE, Mouse IgG FITC (B&D)
Dùng trong kỹ thuật RT – PCR (Wako- Nhật Bản và Invitrogen)
- Isogen; isopropanol
- Dung dịch DEPC - dNTP
- first strand PCR buffer. - DTT (ức chế protein) - HPRI (ức chế Rnase)
- MMLV-RT (enzym tổng hợp)
- Ex Taq Buffer (Takara Bio Inc.Kyoto, Nhật Bản)
Bảng 2.1. Các cặp mồi của kỹ thuật PCR (Invitrogen)
Tên mồi Trình tự mồi xuôi (5’-3’) Trình tự mồi ngƣợc (5’-3’) Kích thƣớc
GATA4 TCAAATTGGGATTTTCCGGA GCACGTAGACTGGCGAGGA 347 bp MEF2A TCCAATTGTGCTTGGCCGA ACATACACACACACTCACACCCA 247 bp MEF2C ACTTTCTGAAGGATGGGCAA CAAGTGCTAAGCTTATCTCAGCA 230 bp MEF2D TGAAGATCCCCCGGACCA CTCGTCGGTGATTCGCTGGA 253 bp Nkx2.5/Csx AGCCCTGGCTACAGCTGCA TGGGAGCCCCTTCTCCCCA 262bp GAPDH ACATGTTCCAATATGATTCC TGGACTCCACGACGTACTCA 350 bp
- actin GAAGATCCTCACCGAGCGC GCGACGTAGCAAGCTTCTCC 90 bp
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu
Đây là nghiên cứu áp dụng quy trình phân lập và nghiên cứu biệt hóa
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
- Phần I: Áp dụng quy trình phân lập, nuôi cấy của Shim và cs để tạo ra tập hợp MSC (n=20); Sử dụng các tiêu chuẩn của ISCT về MSC để nhận biết tế bào nuôi cấy:
Khả năng bám dính vào bề mặt nhựa nuôi cấy.
Biểu hiện âm tính với CD34, CD45; biểu hiện dương tính với CD13, CD73,
CD90.
Khả năng biệt hóa in vitro tạo tế bào mỡ.
Áp dụng quy trình bảo quản và phục hồi nuôi cấy ngẫu nhiên tập hợp MSC sau phân lập, nuôi cấy (n=5).
- Phần II: Áp dụng hai quy trình biệt hóa theo hướng hình thành tế bào cơ tim đối với tập hợp MSC sau phân lập, nuôi cấy (n=5). Đánh giá tế bào sau biệt hóa
in vitro thông qua hình ảnh siêu cấu trúc và sự biểu hiện các marker đặc trưng
TỦY XƢƠNG NGƢỜI MSC Nuôi cấy MSC Hình thái tế bào Marker bề mặt Khả năng biệt hóa tế bào mỡ Âm tính: CD34, CD45 Dương tính: CD13, CD73,,CD90 Biệt hóa TB Cơ tim Hình thái tế bào
Biểu hiện protein Desmin
Biểu hiện gen Bảo quản
MSC
Hình thái tế bào
MEF2A, 2C, 2D GATA4, Nkx2.5/Csx
cho quá trình biệt hóa thành tế bào cơ, tế bào cơ tim so sánh với kết quả của các mẫu không định hướng biệt hóa.
2.3.2. Các quy trình phân lập, nhân nuôi, bảo quản và biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xƣơng ngƣời theo hƣớng tạo tế bào cơ tim trung mô tủy xƣơng ngƣời theo hƣớng tạo tế bào cơ tim
2.3.2.1. Quy trình phân lập tế bào đơn nhân tủy xương của Shim và cs [114]
Tủy xương vùng xương chậu của các bệnh nhân được lấy theo kỹ thuật tại khoa Huyết học Bệnh viện TW Quân đội 108 và khoa Huyết học Bệnh viện Bạch mai, bảo quản trong ống nghiệm có chất chống đông, vô trùng. Dịch tuỷ
xương sẽ được tách lấy các tế bào đơn nhân sau khi lấy mẫu 4 6 giờ.
1) Cho 1 ml tủy xương vào ống Falcon loại 15 ml.
2) Cho tiếp 50 l - Human mesenchymal enrichment cocktail vào trộn đều bằng
pipet. Ủ hỗn dịch tủy xương - cocktail ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
3) Cho 6 ml DMEM - LG - 10% FBS có 100 UI/ml penicillin, 100 g/ml
streptomycin vào hỗn dịch tủy xương trên, trộn đều.
4) Chuẩn bị 1 ống Falcon khác chứa sẵn 7 ml dung dịch Histopaque -1077.
5) Đặt nhẹ nhàng toàn bộ thể tích hỗn dịch tủy xương lên trên lớp dịch
Histopaque - 1,077, tránh để hai lớp dịch lẫn vào nhau.
6) Ly tâm 1500 vòng/ phút x 30 phút, nhiệt độ phòng.
Trước ly tâm Sau ly tâm
Hình 2.1. Mô hình phân lớp tế bào đơn nhân tủy xương bằng kỹ thuật ly tâm theo gradient tỷ trọng Tủy xƣơng DMEM Histopaque 1,077 Huyết tƣơng DMEM TB đơn nhân Histopaque 1,077 Bạch cầu hạt và hồng cầu L LIITTÂÂMM
7) Thu thập lớp tế bào “vòng nhẫn” (khoảng 3 ÷ 4 ml), vào ống Falcon 15 ml khác. Lớp “vòng nhẫn” nằm giữa lớp môi trường nuôi cấy, huyết thanh (màu hồng) ở trên và lớp dịch Histopaque -1,077 (trắng) ở dưới.
8) Cho thêm 5 ml DMEM - LG - 10% FBS, 100 UI/ml penicillin, 100 g/ml
streptomycin vào dịch tế bào vừa thu được.
9) Ly tâm ở 1200 vòng/phút x 10 phút.
10) Loại bỏ dịch nổi, thu lấy cặn tế bào.
11) Lặp lại bước 8, 9, 10.
12) Tạo huyền phù tế bào thu được bằng 4 ml DMEM – LG, 10% FBS, 100
UI/ml penicillin, 100 g/ml streptomycin.
13) Đếm số lượng tế bào, xác định mật độ.
14) Cho dịch huyền phù tế bào vào chai nuôi cấy 25cm2
(P0).
Tiêu chuẩn phân lập thành công: Thu hoạch được > 109
tế bào/ml dịch tủy xương.
2.3.2.2. Quy trình nhân nuôi tế bào gốc trung mô
Nuôi cấy sơ cấp: Đây là giai đoạn P0. Các tế bào đơn nhân sau khi phân lập được từ tủy xương được nuôi cấy sơ cấp trong: DMEM-LG, 10% FBS,
100 UI/ml penicillin, 100 g/ml streptomycin - môi trường nuôi cấy, ở 370C, 5%
CO2.Không thay mới môi trường trong 7 ÷ 9 ngày. Sau đó loại bỏ tế bào không
bám dính bằng cách thay mới môi trường nuôi cấy. Môi trường này được thay mới 2 lần/tuần, liên tục cho đến khi tế bào phát triển 60 ÷ 70 % diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy (khoảng ngày thứ 14 ÷ 21).
Tiêu chuẩn nuôi cấy sơ cấp thành công: Tế bào phát triển và che phủ 70 ÷ 80% bề mặt diện tích nuôi cấy sau 20 ngày.
Cấy chuyển và nuôi cấy thứ cấp: Tiến hành cấy chuyển khi mật độ tế bào đạt 60 ÷ 70% diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy. Ký hiệu P1 – P2 .... theo số lần cấy chuyển.
1) Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ bằng cách đổ bỏ.
3) Tách các tế bào bám khỏi bề mặt chai nuôi bằng trypsin – EDTA 0,25% (2
ml/ chai T25). Ủ trong tủ ấm 37o
C trong vòng 2 ÷ 3 phút (kiểm tra dưới KHV đối pha, nếu tế bào có hình tròn là đã tách khỏi bề mặt nhựa nuôi).
4) Huyền phù bằng môi trường có bổ sung huyết thanh (5 ml/chai T25). Rửa tế
bào bằng ly tâm ở 1000 vòng/5 phút. Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới (tỷ lệ 1/3).
5) Môi trường nuôi cấy được thay mới 2 lần/tuần, liên tục cho đến khi tế bào
phát triển 60 ÷ 70 % diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy.
Tiêu chuẩn nuôi cấy thứ cấp thành công: Tế bào phát triển và che phủ 70 ÷
80% bề mặt diện tích nuôi cấy sau 7 8 ngày sau cấy chuyển.
2.3.2.3. Quy trình bảo quản lạnh, phục hồi nuôi cấy tế bào gốc trung mô
Bảo quản lạnh các tế bào MSC (P1) trong dung dịch bảo quản tế bào, lưu giữ ở - 800
C, trong 3 tháng. Sau thời gian bảo quản, tế bào được đánh thức, phục hồi nuôi cấy theo quy trình nuôi cấy thông thường.
Bảo quản tế bào trong nhiệt độ - 800
C
1) Lấy chai chứa tế bào nuôi cấy ra khỏi buồng nuôi cấy hút bỏ hết môi
trường nuôi cấy cho 5 ml PBS để rửa hút bỏ dung dịch rửa.
2) Cho 1 ml trypsin – EDTA 0,25% lắc nhẹ ủ ở 370C x 2 3 phút (chú ý:
vừa ủ vừa kiểm tra trên KHV quang học, các tế bào bong đều khỏi bề mặt nhựa hoặc giếng nuôi cấy là được, tránh ủ quá lâu tế bào sẽ bị chết).
3) Bất hoạt enzym bằng cách cho vào 10 ml môi trường nuôi cấy có chứa FBS.
4) Ly tâm 1200 vòng/phút x 5 phút bỏ dịch nổi.
5) Pha lại cặn tế bào bằng 10 – 20 ml môi trường (tùy thuộc lượng tế bào).
6) Đếm tế bào (sử dụng buồng đếm Improved Neubauer). Pha 90 µl trypan blue
0,25% và 10 µl dịch tế bào trộn đều đếm tổng số tế bào (n) của 4 ô
vuông xung quanh bằng vật kính x10 Tổng số tế bào thu được: n/4 x 104 x
7) Ly tâm bỏ dịch nổi pha lại bằng môi trường nuôi cấy chứa 10%
DMSO để có khoảng 2 3 x 106 tế bào trong 1 ml.
8) Cho 1 ml dung dịch tế bào vào mỗi ống nghiệm nhỏ (microtube) làm
đông bằng dung dịch iso-propyl alcohol (C3H7OH) như sau: ngâm ống
nghiệm vào bình chứa iso-propyl alcohol để trong tủ lạnh - 800C (mỗi
phút nhiệt độ của dung dịch sẽ giảm - 0,10
C).
9) Sau 1 2 ngày, chuyển ống nghiệm đựng tế bào trực tiếp tủ lạnh – 800C. Sau
3 tháng sẽ đánh thức và phục hồi nuôi cấy tế bào.
Hình 2.2. Dụng cụhạ nhiệt độ bảo quản tế bào nuôi cấy
Phục hồi nuôi cấy tế bào sau bảo quản
1) Lấy các ống nghiệm đựng tế bào ra từ tủ lạnh - 800C mở nhẹ nắp ống
ủ trong bể ấm 370
C (chú ý: khi dung dịch tế bào tan còn lại một cục đã nhỏ bên trong ống là được).
2) Tế bào sau khi rã đông có thể dùng để nuôi cấy tiếp. Ly tâm, rửa tế bào bằng
PBS x 2 lần hòa tế bào bằng môi trường nuôi cấy đưa vào chai nuôi
cấy và nuôi cấy theo quy trình.