Việc định danh tập hợp tế bào thu được sau khi áp dụng quy trình phân lập từ tủy xương và nuôi cấy ngoài cơ thể được tiến hành dựa trên ba tiêu chuẩn nhận biết MSC của ISCT năm 2006.
3.1.2.1. Hình thái tế bào sau phân lập, nuôi cấy
Tập hợp tế bào ngay sau khi phân lập từ tủy xương có dạng hình cầu, đa dạng về kích thước khi quan sát dưới KHV đối pha. Tập hợp tế bào này được
nuôi cấy ngay trong chai nuôi cấy kích thước 25 cm2, với mật độ 105
tế bào/ml môi trường nuôi cấy x 4 ml/chai nuôi cấy.
Hình thái tế bào ở giai đoạn nuôi cấy sơ cấp
Ở giai đoạn nuôi cấy sơ cấp (P0), các tế bào sau khi phân lập được đưa vào
chai nuôi cấy diện tích 25 cm2, giữ trong tủ ổn nhiệt, tránh di chuyển. Tại thời
điểm này các tế bào có dạng hình cầu, lơ lửng trong môi trường nuôi cấy. Sau thời gian 7 ÷ 9 ngày, tiến hành đổ bỏ môi trường cũ, thay môi trường mới và có thể quan sát được một số tế bào hình sợi, hình cầu bám rải rác trên bề mặt nhựa nuôi cấy. Sau khoảng 20 ngày, từ các tế bào bám dính ban đầu một lớp đơn tế bào che phủ phần lớn diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy. Các tế bào này đa dạng về hình thái và là các tế bào dạng nguyên bào sợi (hình sao, hình thoi, hình sợi dài). Một số ít tế bào trong đó vẫn có dạng hình cầu.
Hình 3.1. Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy, ngày thứ 15, giai đoạn P0, (HE x100).
Các tế bào có mật độ thưa thớt (20% diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy), dạng hình sao, hình sợi, hình thoi. Các tế bào phát triển đa hướng trên bề mặt nhựa nuôi cấy.
Hình 3.2. Hình ảnh tế bào bám dính và phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy, ngày thứ 20, giai đoạn P0, (HE x100).
Các tế bào có mật độ tương đối cao (80% diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy), dạng hình sao, hình sợi, hình thoi. Một số tế bào phát triển đồng hướng, nằm song song với nhau trên bề mặt nhựa nuôi cấy.
Hình thái tế bào ở các giai đoạn nuôi cấy thứ cấp
Cấy chuyến được thực hiện mỗi khi mật độ tế bào che phủ > 70% diện tích bề mặt nhựa nuôi cấy. Các tế bào sau khi cấy chuyển nhanh chóng chuyển từ dạng hình cầu sang hình sợi và tiếp tục tăng sinh. Thời gian che phủ ngắn hơn nhiều so với giai đoạn P0, kéo dài 7 ÷ 8 ngày, với tỷ lệ pha loãng tế bào cấy chuyển là 1/3. Các tế bào sau khi bám trở lại bề mặt nhựa nuôi cấy vẫn có hình dạng nguyên bào sợi. Dạng tế bào hình cầu hầu như không xuất hiện trong tập hợp tế bào nuôi cấy ở các lần cấy chuyển sau.
Ngày thứ 3 Ngày thứ 5
Ngày thứ 7 Ngày thứ 8
Hình 3.3. Hình thái và mật độ tế bào sau khi thực hiện cấy chuyển ở giai đoạn P2 (HE x200).
Mật độ tế bào đạt 20% vào ngày thứ 3; đạt 50% vào ngày thứ 5 và đạt 80% vào ngày thứ 7 ÷ 8 sau khi thực hiện cấy chuyển.
Đặc điểm bào tương và nhân của tập hợp tế bào nuôi cấy
Quan sát dưới KHV quang học tiêu bản nhuộm HE tế bào nuôi cấy nhận
thấy: các tế bào có dạng nguyên bào sợi. Đa số tế bào có một nhân to, hình trứng ở trung tâm, một số ít hai nhân nhỏ nằm sát nhau. Các tế bào đa dạng về hình thái bào tương và kích thước nhân. Có thể nhận thấy có hai dạng tế bào chính: dạng I là các tế bào hình sao hình sợi, dạng II là các tế bào hình thoi.
Hình 3.4. Hình thái tế bào nuôi cấy dạng hình sao, hình sợi (HE x100).
Hình 3.5. Hình thái tế bào nuôi cấy dạng hình thoi (HE x100).
- Hình 3.4: Dạng tế bào hình sao, hình sợi có kích thước nhân và bào tương nhỏ (dạng I). Tế bào nuôi cấy có dạng hình sao, hình sợi, một nhân hình trứng ở trung tâm màu xanh đậm, bào tương sáng màu hơn và tương đối gọn. Các tế bào sắp xếp đa hướng trên bề mặt nhựa nuôi cấy.
- Hình 3.5: Dạng tế bào hình thoi có kích thước nhân và bào tương lớn hơn (dạng II). Nhân hình trứng ở trung tâm, màu xanh đậm. Bào tương sáng màu và tương đối rộng, dẹt. Các tế bào có hướng nằm song song với nhau.
Bảng 3.2. Kích thước đường kính ngang của nhân tế bào nuôi cấy (n= 30).
Tế bào nuôi cấy Đƣờng kính ngang nhân (μm) X SD p Dạng I
7,75 0,79 <0,05
Dạng II 11,26 1,68
Đường kính ngang của nhân của tế bào dạng II (tế bào hình thoi) lớn hơn dạng I (tế bào hình sao, hình sợi) có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
3.1.2.2. Kết quả phân tích biểu hiện marker bề mặt tế bào nuôi cấy
Các tế bào sau phân lập và nuôi cấy được xác định sự biểu hiện các marker bề mặt, bao gồm: CD34, CD45, CD13, CD73, CD90; tại các thời điểm: nuôi cấy sơ cấp P0 và các giai đoạn nuôi cấy thứ cấp tiếp theo (giai đoạn cấy chuyển P1, P2, P3). Hai kỹ thuật miễn dịch tế bào được sử dụng để đánh giá: chọn lựa tế bào bằng huỳnh quang (FACS) và hóa miễn dịch tế bào bằng enzym (ICC).
Kết quả phân tích biểu hiện CD34, CD45
Thu hoạch tế bào ở các giai đoạn nuôi cấy để xác định sự biểu hiện CD34 và CD45, đây là hai marker bắt buộc âm tính đối với MSC. Tập hợp tế bào được coi là dương tính với kháng thể đơn dòng của chuột kháng người khi phải có > 10% tế bào của tập hợp có biểu hiện dương tính với kháng thể tương ứng và ngược lại. Tất cả các kết quả phân tích FACS được xác định bằng cách so sánh cường độ tín hiệu huỳnh quang thu được từ detetor tương ứng của mẫu cần xác định với mẫu chứng âm – không ủ với kháng thể kháng đặc hiệu. Kết quả phân tích bằng FACS và ICC cho thấy, tập hợp tế bào nuôi cấy có biểu hiện âm tính với cả CD34 và CD45.
* Kết quả minh họa biểu hiện CD34 của tế bào nuôi cấy bằng FACS
Biểu đồ 3.1. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD34 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P0 và giai đoạn P1; trục tung: số lượng tế bào x100; trục hoành: cường độ huỳnh quang (các phân tích được lặp lại ít nhất 3 lần).
Tập hợp tế bào nuôi cấy giảm dần mức độ biểu hiện đối với CD34 theo giai đoạn cấy chuyển trong quá trình nuôi cấy, biểu hiện âm tính ở giai đoạn P1.
Chứng âm Chứng âm
* Kết quả minh họa biểu hiện CD34 của tế bào nuôi cấy bằng kỹ thuật ICC
Hình 3.6. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P1. : tế bào dương tính với kháng thể kháng CD34 (ICC x200), (các phân tích được lặp lại 3 lần).
Hình 3.7. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD34 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P3 (ICC x 200)
Trên lát cắt mẫu đúc paraphin tế bào nuôi cấy: tế bào hình cầu, đa diện, một số có nhân. Nhân bắt xanh đậm, bào tương bắt màu xanh nhạt hơn.
- Hình 3.6: Một số ít tế bào nuôi cấy (<10%) dương tính với kháng thể kháng CD34 ở giai đoạn P1. Các tế bào này bắt màu ở chu vi tế bào.
- Hình 3.7: Các tế bào âm tính với kháng thể kháng CD34 ở giai đoạn P3.
Biểu đồ 3.2. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD45 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P0 và giai đoạn P1; trục tung: số lượng tế bào x100; trục hoành: cường độ huỳnh quang, (các phân tích được lặp lại 3 lần).
Chứng âm Chứng âm
Tập hợp tế bào nuôi cấy giảm dần mức độ biểu hiện đối với CD45 theo giai đoạn cấy chuyển trong quá trình nuôi cấy, biểu hiện âm tính ở giai đoạn P1.
* Kết quả minh họa biểu hiện CD45 của tế bào nuôi cấy bằng ICC
Hình 3.8. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P1. : tế bào dương tính với kháng thể kháng CD45 (ICC x200), (các phân tích được lặp lại 3 lần).
Trên lát cắt mẫu đúc paraphin tế bào nuôi cấy: tế bào hình cầu, đa diện, một số có nhân. Nhân bắt xanh đậm, bào tương bắt màu xanh nhạt hơn.
- Một số tế bào nuôi cấy dương tính với kháng thể kháng CD45 (<10%) ở giai
đoạn P1. Các tế bào này bắt màu nâu vàng ở chu vi tế bào.
Hình 3.9. Nhuộm kháng thể đơn dòng kháng CD45 trên lát cắt mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P3. : tế bào dương tính với kháng thể kháng CD45 (ICC x200), (các phân tích được lặp lại 3 lần).
Trên lát cắt mẫu đúc paraphin tế bào nuôi cấy: tế bào hình cầu, đa diện, một số có nhân. Nhân bắt xanh đậm, bào tương bắt màu xanh nhạt hơn.
Mẫu tập hợp tế bào âm tính với kháng thể kháng CD45 ở giai đoạn P3.
Kết quả phân tích biểu hiện CD13, CD73, CD90
Nhằm xác định tập hợp tế bào nuôi cấy có biểu hiện các marker được cho là dương tính đối với MSC hay không, sử dụng kỹ thuật FACS phân tích biểu hiện của ba kháng nguyên: CD13, CD73, CD90 ở giai đoạn nuôi cấy sơ cấp (P0) và giai đoạn nuôi cấy thứ cấp P1. Kết quả phân tích FACS cho thấy tập hợp tế bào nuôi cấy dương tính với cả ba marker này ở giai đoạn P1.
* Kết quả minh họa biểu hiện của CD13 của tế bào nuôi cấy bằng FACS
Biểu đồ 3.3. Các biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD13 bề mặt tế bào nuôi cấy giai đoạn P1.
- 3.3.A: Biểu đồ phân bố tế bào theo kích thước và đặc điểm bào tương bằng tín hiệu của các detector FCS (trục tung) và SSC (trục hoành) cho thấy: các tế bào nuôi cấy đa dạng về đặc điểm bào tương và kích thước tế bào.
- 3.3.B: Biểu đồ phân bố tín hiệu phát huỳnh quang của tập hợp tế bào nuôi cấy ủ với kháng thể kháng CD13 gắn PE thu được bằng hai detector FL1 (phát hiện tín hiệu của FITC) và FL2 (phát hiện tín hiệu của PE) cho thấy: các tế bào nuôi
Chứng âm A B A C A D Giai đoạn P1
cấy dương tính với kháng thể kháng CD13 – PE khi thu được tín hiệu huỳnh quang vùng dương tính của detector FL2.
- 3.3.C và 3.3.D: Biểu đồ FACS biểu hiện CD13 của mẫu chứng âm và mẫu phân tích (trục tung: số lượng tế bào x100; trục hoành: cường độ huỳnh quang) cho thấy: các tế bào nuôi cấy biểu hiện dương tính với CD13, giai đoạn P1.
* Kết quả minh họa biểu hiện CD73 của tế bào nuôi cấy bằng FACS
Biểu đồ 3.4. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD73 bề mặt tế bào nuôi cấy
giai đoạn P0 và giai đoạn P1; trục tung: số lượng tế bào x100; trục hoành: cường độ huỳnh quang, (các phân tích được lặp lại 3 lần).
Giai đoạn P0 Giai đoạn P1 Chứng âm Chứng âm
Các tế bào nuôi cấy tăng dần mức độ biểu hiện CD73 trong quá trình nuôi cấy, biểu hiện dương tính ở giai đoạn P1.
* Kết quả minh họa biểu hiện CD90 của tế bào nuôi cấy bằng FACS
Biểu đồ 3.5. Biểu đồ phân tích FACS biểu hiện CD90 bề mặt tế bào nuôi cấy
giai đoạn P0 và giai đoạn P1; trục tung: số lượng tế bào x100; trục hoành: cường độ huỳnh quang, (các phân tích được lặp lại 3 lần).
Giai đoạn P0 Giai đoạn P1 Chứng âm Chứng âm
Các tế bào nuôi cấy tăng dần mức độ biểu hiện CD90 trong quá trình nuôi cấy, biểu hiện dương tính với CD90 ở giai đoạn P1.
Bảng 3.3. Biểu hiện marker bề mặt của tập hợp tế bào nuôi cấy, giai đoạn P1
Marker bề mặt CD34 CD45 CD13 CD73 CD90 Biểu hiện âm tính * * Biểu hiện dƣơng tính * * *
Tập hợp tế bào nuôi cấy có đặc diểm về marker bề mặt của MSC theo tiêu chuẩn của ISCT 2006 ở giai đoạn P1.
Bảng 3.4. Mức độ biểu hiện marker bề mặt CD13, CD90, CD73 trên tế bào nuôi cấy, giai đoạn P1, bằng kỹ thuật FACS
Marker
bề mặt CD13 (n=3) CD73 (n=3) CD90 (n=3) Tỉ lệ dƣơng tính (%)
(X SD) 80,2 2,1 60,3 2,0 78,4 1,5
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy MSC nuôi cấy ở giai đoạn P1 dương tính với các marker bề mặt CD13, CD90, CD73 ở mức độ tương đối cao từ 60 – 80 %.
3.1.2.3. Kết quả xác định khả năng biệt hóa in vitro hình thành tế bào mỡ của tế bào tế bào nuôi cấy
Các tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P1 được tiến hành nuôi cấy biệt hóa theo hướng hình thành tế bào mỡ trong môi trường biệt hóa chuyên biệt. Quan sát dưới KHV đối pha thấy: tế bào sau 10 ngày biệt hóa xuất hiện các hạt mỡ khi nhấp nháy ốc vi cấp của KHV. Tiến hành nhuộm Oil-Red O mẫu tế bào định hướng biệt hóa thấy có các hạt mỡ nằm trong vùng bào tương tế bào. Các mẫu chứng âm là các mẫu tế bào không định hướng biệt hóa hoàn toàn không có biểu hiện này.
Hình 3.10. Tế bào nuôi cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ sau 10 ngày (Phương pháp nhuộm hóa mô Oil – Red O x100).
Hình 3.11. Tế bào nuôi cấy biệt hóa theo hướng tạo tế bào mỡ sau 10 ngày (Phương pháp nhuộm hóa mô Oil – Red O x200).
- Hình 3.10: các hạt mỡ bắt màu đỏ của thuốc nhuộm. Các hạt mỡ kích thước to nhỏ không đồng đều, rải rác trong bào tương và có xu hướng kết tụ thành giọt mỡ lớn hơn ở trung tâm.
- Hình 3.11: ở độ phóng đại lớn hơn, có thể quan sát rõ hơn các hạt mỡ nằm trong ranh giới bào tương của tế bào. Các tế bào chứa các hạt mỡ này là các tế bào đa giác, bào tương rộng và bám bề mặt nhựa nuôi cấy.
3.1.3. Kết quả phục hồi nuôi cấy sau bảo quản tế bào gốc trung mô
Sau 3 tháng bảo quản – 800C, tiến hành nuôi cấy phục hồi tế bào. Quan
sát hình thái tế bào và nhuộm nhân bào tương tế bào bằng phương pháp HE. Đặc điểm phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy và hình dạng giống như tập hợp tế bào nuôi cấy trước khi bảo quản, phục hồi nuôi cấy (Hình 3.12).
Phân tích TEM chưa phát hiện được các cấu trúc bất thường (Hình 3.13).
Hình 3.12. Tế bào gốc trung mô phục hồi nuôi cấy sau bảo quản phát triển trên bề mặt nhựa nuôi cấy (HE x100).
Các tế bào phục hồi nuôi cấy có dạng sợi hoặc hình sao, bào tương bắt màu nhạt hơn, nhân bắt màu đậm, nằm ở giữa. Các tế bào sắp xếp sát nhau, theo các hướng nhất định.
Hình 3.13. Siêu cấu trúc một phần hai MSC phục hồi nuôi cấy; 1- Khoảng gian bào; 2 - Lưới nội bào; 3 - Màng tế bào; 4 - Liên kết khe (TEM x3 000). Trong bào tương có các bào quan nằm rải rác: như lưới nội bào, ti thể. Màng tế bào nhẵn, không tổn thương.
1
2 3 4
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA IN VITRO TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ NUÔI CẤY THEO HƢỚNG TẠO TẾ BÀO CƠ TIM TRUNG MÔ NUÔI CẤY THEO HƢỚNG TẠO TẾ BÀO CƠ TIM
Sau khi khẳng định tập hợp tế bào thu được sau các quy trình phân lập và nuôi cấy ngoài cơ thể là MSC theo các tiêu chuẩn hình thái tế bào, marker bề mặt và khả năng biệt hóa tạo tế bào mỡ được trình bày ở trên, tiến hành nghiên
cứu biệt hóa in vitro các tế bào này theo hướng tạo các tế bào cơ tim. Đánh giá
biến đổi của MSC sau khi áp dụng quy trình của Tomita và cs dựa trên: - Hình thái vi thể, siêu vi thể tế bào.
- Biểu hiện protein khung bào tương đặc trưng cho dòng tế bào cơ: Desmin. - Biểu hiện và mức độ biểu hiện một số gen đặc trưng cho quá trình biệt hóa tế bào cơ, cơ tim: họ MEF2, GATA4, Nkx2.5/Csx.
Biệt hóa MSC theo hướng cơ tim áp dụng quy trình biệt hóa của Shim và cs được bước đầu nghiên cứu thử nghiệm và chỉ đánh giá mức độ biểu hiện một số gen đặc trưng.
3.2.1. Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô theo quy trình của Tomita và cs
3.2.1.1. Hình thái vi thể và siêu vi thể tế bào
Hình thái vi thể
Theo dõi sự biến đổi hình thái vi thể tế bào sau biệt hóa dưới KHV quang học đối pha trong suốt quá trình từ sau khi gây biệt hóa đến khi kết thúc biệt hóa