Sau khi lấy đƣợc tế bào thai bằng phƣơng phỏp trực tiếp, cỏc tế bào thai đú sẽ đƣợc dựng để chẩn đoỏn xỏc định thai nhi cú bị bất thƣờng NST hay khụng và bất thƣờng ở mức độ tế bào hay ở mức phõn tử [30], [35], [38].
1.3.4.1. Phương phỏp di truyền học tế bào (xột nghiệm NST)
Nuụi cấy tế bào ối:
Lƣợng nƣớc ối cần để xột nghiệm NST đƣợc chia đều vào 2 lọ nuụi cấy. Do cỏc tế bào ối là những tế bào bong nờn chỳng cần mụi trƣờng đặc biệt nhƣ mụi trƣờng Chang, Amnio Max để tạo cỏc tế bào sợi bỏm dớnh vào mặt bỡnh nuụi cấy. Nuụi cấy tế bào ối theo phƣơng phỏp hở. Thời gian trung bỡnh để cú kết quả phõn tớch NST từ 10-20 ngày.
Nuụi cấy tế bào mụ (tế bào gai rau, tế bào da, tế bào cơ thai) Nuụi cấy bạch cầu lympho từ mỏu dõy rốn
1.3.4.2. Cỏc phương phỏp di truyền học phõn tử
Kỹ thuật FISH (Fluorescence In Situ Hybridization):
FISH là kỹ thuật lai giữa kỹ thuật tế bào và kỹ thuật phõn tử, dựng một trỡnh tự ngắn của chuỗi ADN sợi đơn, đƣợc gọi là mẫu ADN dũ đƣợc đỏnh dấu bằng cỏc đồng vị phúng xạ. Cỏc mẫu ADN dũ này đƣợc lai với trỡnh tự của ADN trờn tiờu bản NST ở kỳ giữa, kỳ đầu hoặc gian kỳ. Qua đú ta cú thể phỏt hiện, định vị đƣợc vị trớ chuỗi ADN đặc hiệu qua phõn tớch dƣới kớnh hiển vi huỳnh quang để xỏc định cỏc bất thƣờng của NST.
Ƣu điểm là phỏt hiện nhanh chúng những bất thƣờng NST trong vũng 24-48 giờ do sử dụng trực tiếp tế bào ối, tế bào gai rau khụng cần qua nuụi cấy. FISH cú thể phỏt hiện cỏc rối loạn NST nhỏ, cỏc đột biến gen mà phƣơng phỏp phõn tớch NST khụng phỏt hiện đƣợc
Hạn chế của FISH là giỏ thành của mẫu xột nghiệm cao hơn nhiều so với giỏ thành của cỏc mẫu nuụi cấy thụng thƣờng (cấy ối, gai rau…) vỡ vậy khụng phự hợp cho mọi đối tƣợng xột nghiệm.
Phƣơng phỏp phản ứng chuỗi tổng hợp ADN in vitro (PCR):
Trong chẩn đoỏn di truyền trƣớc sinh, ngƣời ta cú thể chẩn đoỏn cỏc HC ba NST 13, 18, 21, HC Turner, cũng nhƣ chẩn đoỏn một số bệnh khỏc nhƣ bệnh xơ nang, bệnh teo cơ giả phỡ đại Duchene, RhD của phụi thai, tỡm ARN của virus… bằng phƣơng phỏp PCR cú gắn huỳnh quang từ những tế bào ối hoặc tế bào rau, tế bào lympho khụng cần qua nuụi cấy.
Nhƣ vậy, cú rất nhiều phƣơng phỏp để chẩn đoỏn xỏc định xem thai cú bị bất thƣờng NST hay khụng nhƣng phƣơng phỏp đƣợc sử dụng nhiều nhất là phƣơng phỏp nuụi cấy tế bào ối do cú nhiều ƣu điểm và giỏ thành xột nghiệm dễ đƣợc chấp nhận hơn so với cỏc kỹ thuật khỏc.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiờn cứu
Thai phụ chọc ối xột nghiệm nhiễm sắc thể thai nhi tại Trung tõm chẩn đoỏn trƣớc sinh - Bệnh viện Phụ sản Trung ƣơng trong 5 năm từ thỏng 6 năm 2006 đến hết thỏng 6 năm 2011.
2.1.1. Tiờu chuẩn chọn lựa
Cỏc thai phụ đƣợc chọn lựa vào nghiờn cứu khi thỏa món cỏc điều kiện sau: - Thai phụ vào khỏm cú chỉ định và loại trừ cỏc chống chỉ định, đồng ý tham gia chọc ối xột nghiệm NST thai nhi; và cú kết quả phõn tớch NST thai nhi tại TTCĐTS-BVPSTƢ.
- Cú hồ sơ ghi chộp đầy đủ cỏc thụng tin đỏp ứng cho nội dung nghiờn cứu. - Trong hồ sơ nghiờn cứu phải ghi rừ chỉ định chọc ối và kết quả phõn tớch NST thai nhi.
2.1.2. Tiờu chuẩn loại trừ
- Thai phụ đƣợc chọc ối nhƣng khụng cú xột nghiệm nhiễm sắc đồ thai nhi.
2.2. Phƣơng phỏp nghiờn cứu 2.2.1. Thiết kế nghiờn cứu 2.2.1. Thiết kế nghiờn cứu
Nghiờn cứu mụ tả hồi cứu cú kết hợp với tiến cứu.
2.2.2. Cỡ mẫu
Tớnh theo cụng thức ƣớc lƣợng tỷ lệ của 1 nhúm nghiờn cứu mụ tả:
n = 2 2 2 1 ) . p ( q . p . z (*)
Trong đú:
n: cỡ mẫu nghiờn cứu
: mức ý nghĩa thống kờ (chọn = 0,05) Z: hệ số tin cậy
Z2 (1- /2): giỏ trị Z = 1,96 tƣơng ứng với = 0,05
: giỏ trị tƣơng đối, chọn = 0,1 p: tỷ lệ bất thƣờng NST bằng 17,5% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(theo nghiờn cứu của Hoàng T. Ngọc Lan (2004) [20], tỷ lệ bất thƣờng NST là 17,5%, vỡ vậy lấy giỏ trị p = 0,175).
q = 1 – p = 0,825
Thay vào cụng thức (*) ta đƣợc:
0,175 . 0,825
n = 1,962 . = 1811 (0,175 . 0,1)2
Vậy cỡ mẫu tối thiểu là 1811
Trong nghiờn cứu này lấy mẫu là 2686, thỏa món cỡ mẫu tối thiểu.
2.3. Cỏc biến số nghiờn cứu 2.3.1. Biến số độc lập 2.3.1. Biến số độc lập
- Cỏc đặc trƣng cỏ nhõn:
+ Tuổi thai phụ đƣợc chia thành cỏc nhúm: 20-24; 25-29; 30-34; 35-39; ≥ 40.
+ Nghề nghiệp: cỏn bộ cụng chức, nụng dõn, nghề khỏc. + Địa dƣ: Hà Nội, tỉnh khỏc.
- Tiền sử sản khoa: sẩy thai liờn tiếp, thai lƣu nhiều lần ≥ 2 lần, đẻ thai DTBS.
- Tiền sử thai nghộn: sốt hoặc dựng thuốc trong 3 thỏng đầu thai kỳ. - Tuổi thai: dựa vào ngày đầu của kỳ KCC hoặc theo siờu õm quý 1. Tuổi thai đƣợc phõn làm 3 nhúm: <16 tuần, 16-20 tuần, >20 tuần.
2.3.2. Biến số phụ thuộc - Chỉ đinh chọc ối: - Chỉ đinh chọc ối:
+ Mẹ ≥35 tuổi
+ Thai phụ cú tiền sử sẩy thai, thai chết lƣu hoặc chết khi sinh, tiền sử đẻ con bị dị tật, đó cú con bị Trisomy; thai phụ hoặc chồng mang NST chuyển đoạn; họ hàng cú ngƣời bị dị tật
+ Siờu õm cú bất thƣờng hỡnh thỏi thai nhi
+ Kết quả xột nghiệm sàng lọc ở huyết thanh mẹ cú nguy cơ cao sinh con bị lệch bội
- Xột nghiệm sàng lọc huyết thanh mẹ:
+ Nguy cơ cao + Nguy cơ thấp
- Kết quả siờu õm hỡnh thỏi thai nhi:
+ Bỡnh thƣờng + Bất thƣờng
- Kết quả nuụi cấy tế bào ối phõn tớch NST thai nhi lập karyotyp:
+ Bỡnh thƣờng
+ Bất thƣờng: HC Down, HC Edwards, HC Patau, HC Turner, H C Klinerfelter, thể đa bội, rối loạn cấu trỳc NST.
2.4. Cỏc tiờu chuẩn đỏnh giỏ trong nghiờn cứu
2.4.1. Đối với XNSL
- Dƣơng tớnh (nguy cơ cao) với: + Hội chứng Down ≥ 1/250
+ Hội chứng Down theo tuổi mẹ ≥ 1/250 + Hội chứng Edwards ≥ 1/100
Thai phụ cú XNSL dƣơng tớnh khi cú từ một nguy cơ dƣơng tớnh trở lờn. - Âm tớnh (nguy cơ thấp) quy định khi kết quả nhỏ hơn ngƣỡng nguy cơ dƣơng tớnh. Thai thuộc nhúm nguy cơ thấp đối với cỏc DTBS: HC Down, HC Edwards. Tuy nhiờn, khụng loại trừ hoàn toàn khả năng trẻ cú thể bị dị tật. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.2. Đối với siờu õm - Bỡnh thƣờng - Bỡnh thƣờng
- Bất thƣờng: đƣợc đỏnh giỏ dựa theo cỏc tiờu chuẩn chẩn đoỏn siờu õm [10], [48], [49]. Cỏc hỡnh ảnh bất thƣờng hay gặp trờn siờu õm nhƣ sau:
+ Khoảng sỏng sau gỏy: ≥3,0mm đo ở tuổi thai từ 11 tuần đến 13 tuần 6 ngày.
+ Da gỏy ≥7,0mm đo ở tuổi thai 3 thỏng giữa.
+ Gión nóo thất bờn: đƣờng kớnh nóo thất bờn 10-15mm.
+ Nang đỏm rối mạch mạc: trờn đƣờng cắt ngang đầu trung bỡnh thấy nang đỏm rối mạch mạc ở một hoặc hai bờn, hỡnh trũn, thƣa õm vang.
+ Nang bạch huyết vựng cổ: nang dịch thƣa õm vang, cú vỏch nằm ở vựng cổ.
+ Khe hở mụi - vũm miệng: cung mụi trờn ngắt quóng một hoặc hai bờn, kộo dài đến mũi. Nếu khuyết hai bờn, phần xƣơng hàm ở giữa hai khe hở mụi lồi ra phớa trƣớc.
+ Thoỏt vị cơ hoành: hỡnh ảnh thƣa õm vang nằm ở giữa tim ở phớa trƣớc cột sống ở sau, đú chớnh là dạ dày trong lồng ngực, khụng thấy dạ dày trong ổ bụng.
+ Teo thực quản: khụng thấy hỡnh ảnh dạ dày hay dạ dày nhỏ, đa ối.
+ Thụng liờn thất: trờn diện cắt qua bốn buồng tim, hỡnh ảnh lỗ thụng ở vỏch liờn thất lỗ thụng ở cao hay thấp của vỏch. Doppler thấy dũng chảy qua vỏch.
+ Bệnh phổi tuyến nang: hỡnh ảnh phổi tăng õm vang, trong nhu mụ phổi cú nhiều nang to nhỏ khụng đều, khụng thụng với nhau, cơ hoành bị đẩy về phớa ổ bụng, tim và trung thất bị đẩy lệch về một phớa
+ Tràn dịch màng phổi: trờn đƣờng cắt ngang ngực hay đƣờng cắt dọc bờn lồng ngực thấy dịch đồng nhất nằm ở ngoại biờn của lồng ngực.
+ Thoỏt vị rốn: khối trũn, cú màng bọc lồi ra khỏi thành bụng trƣớc, lỗ thoỏt vị nằm ở vựng rốn, trong khối thoỏt vị chứa ruột non, đụi khi cú chứa dạ dày, gan, đại tràng.
+ Loạn sản sụn xƣơng: cỏc xƣơng dài biến dạng, cong và ngắn, gẫy. Lồng ngực hẹp. Hộp sọ bị biến dạng [10].
+ Và cỏc dấu hiệu bất thƣờng khỏc phỏt hiện đƣợc trờn siờu õm...
2.4.3. Kết hợp siờu õm và XNSL
- Cỏc thai phụ đều cú kết quả XNSL huyết thanh và siờu õm hỡnh thỏi, chỉ xột trƣờng hợp dƣơng tớnh khi trờn một thai phụ cú siờu õm bất thƣờng và XNSL(+).
2.4.4. Kết quả phõn tớch NST từ tế bào ối
NST đƣợc phõn tớch theo tiờu chuẩn của hội nghị quốc tế về di truyền ngƣời 2005 [4]:
- Bỡnh thƣờng: 46,XX (nữ bỡnh thƣờng); 46,XY (nam bỡnh thƣờng) - Bất thƣờng NST: bất kỳ thay đổi nào về số lƣợng hay cấu trỳc của NST thƣờng hay NST giới.
2.4.5. Chẩn đoỏn thai bất thƣờng NST
2.5. Phƣơng tiện nghiờn cứu
- Mỏy SA: mỏy Aloka 3500 với đầu dũ convex
- Kim chọc hỳt dịch ối (thƣờng dựng kim chọc tuỷ sống cỡ 20G) - Bơm tiờm 20ml: 2 cỏi
- Tuýp vụ trựng cú nắp đậy để bảo quản và vận chuyến mẫu nƣớc ối - Mụi trƣờng nuụi cấy tế bào ối: mụi trƣờng AmnioMax
- Kớnh hiển vi điện tử
- Dụng cụ để nuụi cấy: lọ thuỷ tinh trung tớnh, ống hỳt, quả búp ống ly tõm, nỳt cao su, bụng, cồn
- Dung dịch Giờmsa để nhuộm tiờu bản NST - Phiếu thu thập thụng tin
2.6. Cỏc bƣớc tiến hành và thu thập thụng tin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Trờn cỏc bệnh ỏn (hồi cứu): cỏc thụng tin cú sẵn từ bệnh ỏn sẽ đƣợc ghi chộp lại vào phiếu thu thập thụng tin (phụ lục I).
- Trờn bệnh nhõn đến khỏm (tiến cứu): + Phỏng vấn thai phụ theo mẫu bệnh ỏn
+ Chọc ối tại TTCĐTS-BVPSTƢ, kỹ thuật và quy trỡnh (phụ lục II) + Nuụi cấy tế bào ối làm NSĐ thai và đọc kết quả tại Bộ mụn di truyền - Trƣờng Đại học Y Hà Nội.
+ Những trƣờng hợp chẩn đoỏn xỏc định thai DTBS đều đƣợc thụng qua hội đồng chẩn đoỏn trƣớc sinh.
+ Thu thập thụng tin theo mẫu.
2.7. Phƣơng phỏp tớnh toỏn và xử lý số liệu
- Xử lý số liệu bằng chƣơng trỡnh thống kờ y học sử dụng phần mềm SPSS 16.0.
+ Test 2để so sỏnh sự khỏc nhau giữa cỏc tỷ lệ %.
+ Test Fisher chớnh xỏc để so sỏnh sự khỏc nhau giữa 2 tỷ lệ khụng đủ điều kiện tớnh 2(tần số lý thuyết <5).
+ Tớnh tỷ suất chờnh OR với khoảng tin cậy CI 95%.
+ Đỏnh giỏ giỏ trị của cỏc phƣơng phỏp sàng lọc thụng qua cỏc thụng số sau:
Kết quả sàng lọc Kết quả nhiễm sắc đồ tế bào ối Tổng số
Bất thƣờng Bỡnh thƣờng
Dƣơng tớnh a b a + b
Âm tớnh c d c + d
Tổng số a + c b + d a + b + c + d
Giỏ trị tiờn đoỏn dƣơng tớnh: số NSĐ thai bất thƣờng trong số những thai phụ sàng lọc dƣơng tớnh: GT (+) =
b a
a
OAPR (Odds of being affected given a positive result): tỷ lệ thai phụ cú kết quả NSĐ bất thƣờng trờn thai phụ cú NSĐ bỡnh thƣờng trong nhúm sàng lọc dƣơng tớnh: OAPR =
b a
2.8. Vấn đề đạo đức trong nghiờn cứu
- Tiến hành nghiờn cứu với tinh thần trung thực.
- Nghiờn cứu chỉ nhằm bảo vệ và nõng cao sức khoẻ cho đối tƣợng nghiờn cứu và cộng đồng, khụng nhằm mục đớch nào khỏc.
- Tất cả cỏc thai phụ tham gia nghiờn cứu đều tự nguyện và đƣợc ký giấy cam kết, đƣợc tƣ vấn về quy trỡnh chọc ối. Trao đổi rừ mục đớch, ý nghĩa, giỏ trị, cũng nhƣ cỏc nguy cơ và tỏc dụng khụng mong muốncủa phƣơng phỏp
chọc ối để chẩn đoỏn xỏc định những thai cú bất thƣờng NST. Những cặp vợ chồng tự nguyện đồng ý chọc ối phải ký giấy cam đoan sau đú mới đƣợc thực hiện thủ thuật trong điều kiện tốt nhất.
- Cỏc thụng tin liờn quan đến đối tƣợng nghiờn cứu đƣợc giữ bớ mật, chỉ phục vụ cho mục đớch nghiờn cứu.
- Cỏc kết quả siờu õm, kết quả NSĐ, hỡnh ảnh của thai nhi chỉ đƣợc sử dụng khi đƣợc sự đồng ý, cho phộp của thai phụ và gia đỡnh thai phụ.
Chƣơng 3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU
Qua nghiờn cứu 2686 thai phụ chọc ối tại Trung tõm chẩn đoỏn trƣớc sinh - Bệnh viờn Phụ Sản Trung ƣơng chỳng tụi đó thu đƣợc kết quả sau:
3.1. Đặc điểm của đối tƣợng nghiờn cứu: 319 403 686 600 678 0 100 200 300 400 500 600 700 2007 2008 2009 2010 2011 Số BN Năm
Biểu đồ 3.1. Số bệnh nhõn chọc ối theo năm Nhận xột:
- Số bệnh nhõn chọc ối tăng dần từ 2007-2011, tăng nhiều nhất là năm 2009.
Bảng 3.1. Tỷ lệ thai phụ chọc ối trong tổng số đẻ Năm Tổng số đẻ Tổng số chọc ối Tỷ lệ (%) 2007 20.549 319 1,6 2008 19.266 403 2,1 2009 18.818 686 3,6 2010 17.572 600 3,4 2011 17.000 678 4,0 Tổng số 93.205 2686 2,9 Nhận xột:
- Tỷ lệ số thai phụ chọc ối trờn tổng số đẻ trong 5 năm là 2,9%.
Bảng 3.2. Đặc điểm tuổi mẹ trong nghiờn cứu
Đặc điểm Số lƣợng % Tuổi mẹ ≤ 19 17 0,6 20-24 247 9,2 25-29 666 24,8 30-34 733 27,3 35-39 715 26,6 ≥ 40 308 11,5 Tổng 2686 100 Tuổi mẹ trung bỡnh 29,02 ± 5,6 Nhận xột:
- Nhúm tuổi hay gặp nhất từ 30-34 tuổi chiếm tỷ lệ 27,3%. Tuổi trung bỡnh của nhúm nghiờn cứu là 29,02 ± 5,6.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2007 2008 2009 2010 2011 > 40 35-39 30-34 25-29 20-24 ≤ 19
Biểu đồ 3.2. Số bệnh nhõn chọc ối theo tuổi mẹ
59% 41%
Hà Nội Nơi khỏc
Biểu đồ 3.3. Phõn bố theo địa dư Nhận xột:
- Nhúm thai phụ ở Hà Nội chiếm tỷ lệ 59%, cao hơn so với nhúm thai phụ sống ở cỏc tỉnh khỏc.
2014 217 455 0 500 1000 1500 2000 2500 CBCC Nụng dõn Nghề khỏc Số BN Nghề nghiệp
Biểu đồ 3.4. Phõn bố nghề nghiệp của thai phụ Nhận xột:
- Nhúm thai phụ là CBCC chiếm tỷ lệ cao nhất 75%. Thai phụ là nụng dõn chiếm tỷ lệ thấp nhất 8,1%.
Bảng 3.3. Tuổi thai ở thời điểm chọc ối
Tuổi thai (tuần) Số bệnh nhõn Tỷ lệ (%)
< 16 47 1,7
16-20 1442 53,7
>20 1197 44,6
Tổng số 2686 100
Nhận xột:
- Phần lớn cỏc trƣờng hợp chọc ối đƣợc thực hiện ở tuổi thai 16-20 tuần (53,7%). Chọc ối muộn (>20 tuần) chiếm tỷ lệ 44,6%; chọc ối sớm (<16 tuần) chiếm tỷ lệ 1,7%.
Bảng 3.4. Số bệnh nhõn chọc ối theo chỉ định Năm Chỉ định Tổng Mẹ ≥ 35 XNSL (+) SÂ bất thƣờng TS bất thƣờng n % n % n % n % n % 2007 293 45,4 217 33,6 119 18,5 16 2,5 645 100 2008 229 31,1 323 44 161 21,9 22 3 735 100 2009 184 24,1 380 49,7 168 22 32 4,2 764 100 2010 170 20,3 461 55 181 21,6 26 3,1 838 100 2011 147 17,5 490 58,5 177 21,1 24 2,9 838 100 Tổng 1023 26,8 1871 49 806 21,1 120 3,1 3820 100 (Cú 1850 trƣờng hợp chọc ối do 1 chỉ định, 704 trƣờng hợp cú 2 chỉ định và 132 trƣờng hợp cú 3 chỉ định phối hợp). Nhận xột:
- Chỉ định chọc ối gặp nhiều nhất mỗi năm là XNSL(+) (49%), tiếp theo là mẹ lớn tuổi (26,8%), siờu õm hỡnh thỏi cú bất thƣờng (21,1%) và tiền sử thai phụ bất thƣờng (3,1%).
0 100 200 300 400 500 600 2007 2008 2009 2010 2011 Mẹ ≥ 35 XNSL (+) SÂ bất thƣờng TS bất thƣờng Năm Số BN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Biểu đồ 3.5. Phõn bố số bệnh nhõn chọc ối theo chỉ định
Nhận xột:
- Số chọc ối vỡ mẹ lớn tuổi giảm dần từ 2007-2011. Ngƣợc lại, số chọc ối vỡ XNSL(+) tăng dần.