3.3.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit latex
Để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit latex, phản ứng ngưng kết được thực hiện với dàn mẫu thử là các mẫu nước trứng (Allantoic fluid), đây là dịch niệu mô của trứng gà có phôi được gây nhiễm bằng virus lấy từ thực địa. Kết quả thử nghiệm thu được ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm bộ kit latex với các mẫu nước trứng
STT Ký hiệu Loại mẫu Kit latex Phƣơng pháp
ngƣng kết hồng cầu
1 A1945 Allantoic fluid +++ +
2 A1457 Allantoic fluid +++ +
3 A1433 Allantoic fluid +++ +
4 A1249 Allantoic fluid +++ +
5 A1440 Allantoic fluid + +
6 A1932 Allantoic fluid + +
7 A1416 Allantoic fluid ++ +
8 A1928 Allantoic fluid + +
9 A1974 Allantoic fluid + +
10 A1938 Allantoic fluid + +
11 A1833 Allantoic fluid ++ -
12 A1832 Allantoic fluid + +
13 A1747 Allantoic fluid ++ +
14 A1813 Allantoic fluid + +
15 A1814 Allantoic fluid + +
16 GS4-159 Allantoic fluid - -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
18 GS4-10 Allantoic fluid - -
19 GS4-170 Allantoic fluid - -
20 GS4-346 Allantoic fluid - -
Ghi chú: Các mẫu có số thứ tự từ 16 đến 20 là các mẫu nước trứng không lây nhiễm virus H5N1, các mẫu từ 1 đến 15 là các mẫu nước trứng lây nhiễm virus H5N1 lấy từ thực địa. Ký hiệu (-) mẫu âm tính, (+) mẫu dương tính, (++) mức độ ngưng kết cao có thể quan sát dễ dàng bằng kính hiển vi có độ phóng đại 10×10, (+++) mức độ ngưng kết mạnh có thể quan sát tủa dễ dàng bằng mắt thường.
Kết quả thực hiện phản ứng ngưng kết với 20 mẫu thử dạng nước trứng ở bảng 3.1 cho thấy, bộ kit ngưng kết latex hoạt động rất ổn định với các mẫu dương tính và không có hiện tương dương tính giả. Các mẫu dương tính có số thứ tự từ 1 đến 15 đều cho kết quả ngưng kết với các mức độ khác nhau. Đáng chú ý các mẫu có số thứ tự từ 1 đến 4 cho kết quả ngưng kết mạnh và dễ dàng quan sát được bằng mắt thường hiện tượng kết tủa chỉ sau 3 phút ngưng kết. Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit latex được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit latex
Sinh phẩm Mẫu nước trứng Cộng
Dương tính Âm tính
Kit latex Dương tính 15 0 15
Âm tính 0 5 5
Cộng 15 5 20
Các kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, bộ kit latex có độ nhạy là 15/15 (100%), độ đặc hiệu là 5/5 (100%).
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp ngưng kết hồng cầu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sinh phẩm Mẫu nước trứng Cộng
Dương tính Âm tính Ngưng kết hồng cầu Dương tính 14 1 15 Âm tính 1 4 5 Cộng 15 5 20
Trong 15 mẫu nước trứng có lây nhiễm virus H5N1, phương pháp ngưng kết hồng cầu chỉ khả năng phát hiện được 14/15 dương tính. Do đó, độ nhạy của phương pháp này là 14/15 (93,33%) và độ đặc hiệu là 4/5 (80%). Từ các kết quả trên có thể thấy, bộ kit ngưng kết latex có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với phương pháp ngưng kết hồng cầu.
Bộ kit latex chẩn đoán virus cúm A/H5N1 do chúng tôi tạo ra có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với bộ kit latex chẩn đoán virus cúm A/H5N1 do Xu và cộng sự tạo ra năm 2005, với độ nhạy là 88,8% và độ đặc hiệu là 97,6% [66]. Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit latex chẩn đoán virus cúm A/H5N1 của Xu và cộng sự được đánh giá trên một lượng mẫu thử lớn (830 mẫu) và kết quả cũng cho thấy phương pháp ngưng kết hạt latex có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với phương pháp ngưng kết hồng cầu [66].
Để đánh giá tính đặc hiệu với kháng nguyên H5 của virus H5N1, bộ kit latex được kiểm tra với ba mẫu virus khác nhau gồm: virus H9N2, virus Newcastle và virus H5N1. Trong đó, virus Newcastle là virus gây bệnh gây dịch tả ở gà do nhóm Paramyxovirus gây nên, có triệu chứng biểu hiện bệnh giống với cúm A/H5N1. Virus H9N2 thuộc nhóm Influenza A virus gây bệnh cúm ở chim. Mẫu A1538 có chứa virus H5N1 được dùng làm đối chứng. Kết quả thu được tại bảng 3.5.
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu với kháng nguyên H5 của bộ kit latex
STT Ký hiệu Virus Kit latex
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2 1102 Newcastle Âm tính
3 A1538 H5N1 Dương tính
Từ bảng 3.4 cho thấy, trong ba loại virus được dùng cho phản ứng ngưng kết latex thì bộ kit latex cho kết quả âm tính với hai mẫu virus Newcastle và H9N2, mẫu virus H5N1 cho kết quả dương tính. Do đó có thể thấy kit ngưng kết latex chỉ đặc hiệu với kháng nguyên H5 virus cúm A/H5N1.
3.3.2. Đánh sự hoạt động của bộ kit latex với các mẫu thực địa
Để đánh giá khả năng hoạt động của bộ kit latex, chúng tôi sử dụng các mẫu chứa virus H5N1 thu ngoài thực địa. Đây là những mẫu chứa virus có chứa các chất tạp nhiễm từ môi trường xung quanh nên lượng virus thường thấp, đã được đánh giá trước sự có mặt của virus bằng phản ứng Real time PCR tại Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương. Các mẫu sử dụng gồm 2 loại:
Loại mẫu thứ nhất là dịch nghiền mô và não (Homo) của gia cầm nghi nhiễm cúm, gồm 8 mẫu (A1538, A1544, A1546, A1547, A1548, A1549, A1567, A1586) trong đó mẫu A1567 cho phản ứng âm tính với phản ứng Real time PCR.
Loại mẫu thứ hai là mẫu dịch ngoáy hầu họng của gia cầm nghi nhiễm cúm (Swab), gồm 12 mẫu (A1562, A1563, A1564, A1565, A1566, N156, N157, N158, N160, V187, V544, V550), trong đó có 4 mẫu (A1562, A1563, A1564, A1565) cho kết quả âm tính với phản ứng Real time PCR. Kết quả thử nghiệm thu được ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm bộ kit latex phát hiện virus cúm A/H5N1 với các mẫu thực địa
ST
T Ký hiệu Loại mẫu
Phƣơng pháp
Real time PCR Kit latex
Phƣơng pháp ngƣng kết
hồng cầu
1 A1538 Homo + ++ -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 A1546 Homo + + - 4 A1547 Homo + + - 5 A1548 Homo + ++ - 6 A1549 Homo + + - 7 A1586 Homo + ++ + 8 A1567 Homo - - - 9 A1562 Swab - - - 10 A1563 Swab - - - 11 A1564 Swab - - - 12 A1565 Swab - - - 13 A1566 Swab + + + 14 N156 Swab + + + 15 N157 Swab + ++ + 16 N158 Swab + ++ + 17 N160 Swab + ++ - 18 V187 Swab + + + 19 V544 Swab + + + 20 V550 Swab + + -
Ghi chú: Các mẫu có số thứ tự từ 8 đến 12 là các mẫu âm tính khi kiểm tra bằng phản ứng Real Time PCR. Ký hiệu (-) mẫu âm tính, (+) mẫu dương tính, (++) mức độ ngưng kết cao có thể quan sát dễ dàng bằng kính hiển vi có độ phóng đại 10×10, Homo: Mẫu dịch nghiền tổ chức là dịch nghiền não và phổi gia cầm nghi mắc cúm, Swab: Mẫu dịch ngoáy là dịch ngoáy họng gia cầm nghi mắc cúm, bảo quản trong dung dịch PBS.
Phản ứng ngưng kết được thực hiện với 20 mẫu thực địa, kết quả ở bảng 3.5 cho thấy bộ kit latex không phát hiện được cụm tủa tại các mẫu âm tính với phản ứng Real time PCR. Ở các mẫu cho kết quả dương tính với phản ứng Real time PCR thì khi thử với phản ứng ngưng kết latex đều xuất hiện các cụm tủa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đặc biệt các mẫu A1538, A1544 A1548, A1586, N157, N158, N160 cho thấy các cụm tủa rất rõ ràng khi soi lên kinh hiển vi có độ phóng đại 10×10.
Kết quả ở bảng 3.5 cũng cho thấy, khả năng phát hiện virus với các mẫu thực địa của phương pháp ngưng kết ngưng kết hồng cầu kém hơn nhiều so với phương pháp ngưng kết latex. Trong 15 mẫu dương tính với phản ứng Real time PCR, phương pháp ngưng kết hồng cầu chỉ cho kết quả dương tính với 7 mẫu. Điều này có thể giải thích là do các mẫu thực địa có độ tinh sạch không cao và lẫn nhiều tạp chất gây ảnh hưởng tới phản ứng ngưng kết hồng cầu.
Như vậy, bộ kit latex cho kết quả chẩn đoán virus cúm A/H5N1 tương tự với phương pháp Real time PCR, do đó có thể dùng bộ kit latex để phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu thu ngoài thực địa.
CHƢƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
- Đã biểu hiện thành công kháng thể đơn chuỗi VH10 trong vi khuẩn E. coli
HB2151 và đã tối ưu hóa biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10 với các điều kiện: nhiệt độ nuôi cấy 30oC, chất cảm ứng IPTG 1 mM, thời gian cảm ứng 5h.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sau khi tinh sạch qua cột sắc ký ái lực, lượng protein VH10 thu được là 1,43 mg/ml.
- Đã gắn thành công kháng thể đơn chuỗi VH10 lên bề mặt hạt latex ở lượng tối ưu là 0,4 mg kháng thể/12,5 mg hạt latex và đã xây dựng thành công mô hình thử nghiệm tạo kit phát hiện nhanh cúm A/H5N1 theo nguyên lý ngưng kết miễn dịch.
- Bộ kit latex có độ nhạy 100% và tính đặc hiệu 100% với virus H5N1 trong các mẫu nước trứng. Đồng thời, bộ kit latex có khả năng phát hiện được virus cúm A/H5N1 trong các mẫu thực địa.
KIẾN NGHỊ
- Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 với số lượng lớn mẫu thử.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình (2007), Báo cáo tổng kết đề tài độc lập cấp nhà nước: “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia
cầm” (2006-2007), Trung tâm Thông tin và Tư liệu Quốc gia và Bộ Khoa
học và Công nghệ, Hà Nội.
2. Lê Trần Bình, Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Nguyễn Thị Bích Nga, Trương Nam Hải (2006), “Phân tích mối tương đồng kháng nguyên và miễn dịch của virus cúm A các chủng cường độc đương nhiễm và các chủng vaccine cúm A/H5N1”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 4(3): 291-296.
3. Lê Đình Chắc, Nguyễn Thị Thu Thủy, Lê Quang Huấn (2010), “Tạo kháng thể scFv đặc hiệu kháng nguyên Cyfra21-1”, Tạp chí Y học Việt Nam,
372(2): 163-167.
4. Nguyễn Tiến Dũng (2008), “Vài nét về virut cúm gia cầm H5N1”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XV(4): 80-86.
5. Nguyễn Tiến Dũng, Malik Peiris, Robert Webster, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Nguyễn Thế Vinh, Kent Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Không Ngô Thanh Long (2004), “Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam năm 2003-2004”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(3): 6-14.
6. Chu Hoàng Hà, Phạm Minh Tuấn, Đồng Văn Quyền, Phan Trọng Hoàng, Lê Trần Bình, Đinh Duy Kháng (2007), “Nghiên cứu tạo hạt Latex gắn HBcAg để phát hiện kháng thể kháng HBcAg trong huyết thanh bệnh nhân viêm gan B”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(3): 285-290.
7. Lê Thanh Hoà, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Trần Bình (2008), “Virus cúm A/H5N1: Vấn đề dịch tễ học, tiến hoá, hình thành genotype và tương đồng kháng nguyên - miễn dịch-vaccine”, Tạp chí Công
nghệ Sinh học, 6(4A): 529-553.
8. Lê Thanh Hòa (2006), Y-Sinh học phân tử, Nhà xuất bản Y học, quyển I, 29-48. 9. Lê Thanh Hòa (2006a), “Chiến lược nghiên cứu ứng dụng virus vector tái tổ
hợp trong sản xuất vaccine thế hệ mới”, Tạp chí Công nghệ Sinh học
4(4): 397-416.
10. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, và cộng sự (2005), “Nghiên cứu sinh học phân tử các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập ở Việt Nam tại Viện công nghệ sinh học”, Hội nghị khoa học kỉ niệm 30 năm Viện Khoa học và Công nghệ sinh học (19/05/2005): 75-82.
11. Lê Quang Huấn, Lã Thị Huyền (2009), Kháng thể tái tổ hợp và ứng dụng, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà Nội.
12. Lê Quang Huấn, Nguyễn Thị Thu Thủy, Lã Thị Huyền (2010), “Sử dụng kháng thể phage kết hợp Real-time pCR để định lượng kháng nguyên epca trong ung thư tiền liệt tuyến”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3B): 1121- 1126.
13. Lê Quỳnh Mai (2011), “Sự khác nhau về kiểu hình HA của virus cúm gia cầm độc lực cao A/H5N1 gây bệnh cho người tại Việt Nam”, Tạp chí Y học thực hành,5(764): 73-75.
14. Một số tư liệu về dịch cúm gia cầm vừa qua ở Việt Nam (2004), “Báo cáo tổng kết công tác phòng chống dịch cúm gia cầm của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(3): 99-100. 15. Nguyễn Thị Kim Tiến (2005), “Dịch tễ học, virus học bệnh cúm A(H5N1)
trên người tại khu vực phía Nam”, Tạp chí Y học thực hành, 517: 46-49. 16. Phạm Văn Ty (2004), Miễn dịch học, NXB Ðại học Quốc gia, Hà Nội.
17. Trần Quang Vui, Lê Thanh Hòa (2008), “Nghiên cứu thành phần gen H5 của virus H5N1 phân lập từ vịt tại Thừa Thiên Huế”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, 12(46): 137-144.
18. Cao Bảo Vân, Võ Hồ Hồng Hải, Ngô Thanh Long, Lê Hà Tầm Dương (2005), “Đánh giá về độc tính và khả năng lây cho người của virus cúm A/H5N1 qua các vụ dịch 2004-2005 tại miền Nam Việt Nam qua giám sát đột biến gen”, Tạp chí Y học dự phòng, 16(6): 5-10.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
19. Alexander DJ (2007), “Summary of avian influenza activity in Europe, Asia, Africa, and Australasia, 2002-2006”, Avian Dis, 51: 161-6.
20. Andris WJ, Steinberger P, Barbas CF (2001), “Bacteriophage display of combinatorial antibody libraries”, Encyclopedida of Life Sciences. 1-6. 21. Basler C (2007), “ Influenza viruses: basic biology and potential drug
targets”, Infect Disord Drug Targets, 7(4): 282-93.
22. Berlioz AA, Marfel M, Durand A M, Ogawa T (2005), “Evaluation of a New Anti-Dengue Virus IgM Particle Agglutination Kit in the Context of the Pacific Islands”, Dengue Bulletin, (29): 70-78.
23. Bender C, Hall H, Huang J, Klimov A, Cox N, Hay A, Gregory V, Cameron K, Lim W, Subbarao K (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997- 1998”, Virology, 254: 115-123.
24. Biswas SK, Nayak DP (1996), “Influenza virus polymerase basic protein 1 interacts with influenza virus polymerase basic protein 2 at multiple sites”, J Virol,70(10): 6716-6722.
25. Brichta J, Vesela H, Franek M (2003), “Production of scFv recombinant fragments against 2,4-dichlorophenoxyacetic acid hapten using naïve phage library”, Vet. Med. – Czech, 48(9): 237–247 .
26. Castrucci MR, Kawaoka Y (1993), “ Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus”, J Virol, 67(2): 759-764. 27. Chen JM, Ma HC, Chan JW, Sun YX, Li JM, Wang ZL (2007), “A
preliminary panorama of the diversity of N1 subtype influenza viruses”,
28. Cheng X, Zhang Y, Kotani N, Tae W, Seungho L, Xiangchun W, Ikuo K, Tadashi T, Naoyuki T, Koichi H (2005), “Production of a recombinant single-chain variable-Fragment (scFv) antibody against Sulfoglycolipid”, J
Biochem, 137: 415-421.
29. de Kruif J, Terstappen L, Boel E, Logtenberg T (1995), “Rapid selection of cell subpopulation-specific human monoclonal antibodies from a synthetic phage antibody library”, Proc Natl Acad Sci USA, 92(9): 3938–3942.
30. Fuh G, Sidhu S S (2000), “Efficient phage display of polypeptides fused to the carboxy-terminus of the M13 gene-3 minor coat protein”, FEBS Lett, 480: 231-234.
31. Gao C, Mao S, Lo CH, Wirsching P, Lerner RA, Janda KD (1999), “Making artificial antibodies: a format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays”, Proc Natl Acad Sci USA, 96(11): 6025-6030. 32. Gao C, Mao S, Kaufmann G, Wirsching P, Lerner RA, Janda KD (2002), “A method for the generation of combinatorial antibody libraries