2.2.1. Hóa chất
* Môi trường và hóa chất dùng cho biến nạp vector tái tổ hợp mang gen mã hóa kháng thể VH10 vào E. coli
- Môi trường LB lỏng: 10g/l bacto-trypton, 5g/l cao nấm men, 10 g/l NaCl, pH 7.0 và bổ sung thêm 15g/l agar cho môi trường LB đặc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Glycerol - Nitơ lỏng
- Hóa chất dùng cho phản ứng colony PCR: các thành phần cần thiết được cung cấp bởi hãng Fermentas: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq Buffer 10x. Thành phần phản ứng PCR được liệt kê ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng colony PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước khử ion 15,5 2 Taq Buffer 10x 2,5 3 MgCl2 (25 mM) 2,5 4 dNTPs (10 mM) 2
5 Mồi pTI2-NcoI-F (10 pmol/µl) 1
6 Mồi pTI2-NotI-R (10 pmol/µl) 1
7 Taq polymerase (1U/1 µl) 0,5
8 Khuẩn lạc -
Tổng 25
- Hóa chất dùng cho điện di DNA:
+ Đệm TAE 50X (Tris-acetate-EDTA): 242 g Tris base; 57,2 ml axit Acetic; 100 ml EDTA 0,5 M; bổ sung nước cất vừa đủ 1000 ml.
+ Gel agarose 1%: 1g Agarose, bổ sung đệm TAE 1X vừa đủ 100 ml. + Ethidium bromide: 10 mg/ml
* Hóa chất dùng cho biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10 trong E. coli
- IPTG
- PBS 10X: 140 mM NaCl; 27 mM KCl; 100 mM Na2HPO4; 18 mM KH2PO4. - Urea
* Hóa chất dùng cho tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Native Binding Buffer (30 ml):
+ Dung dịch Native Purification Buffer 1X: 250 mM NaH2PO4, pH 8,0; 2,5 M NaCl.
+ Imidazole 3 M, pH 6,0: 100 μl.
+ Đem trộn đều và điều chỉnh đến pH 8,0 - Native Wash Buffer (50 ml)
+ Dung dịch Native Purification Buffer 1X: 250 mM NaH2PO4, pH 8,0; 2,5M NaCl),
+ Imidazole 3 M; pH 6,0: 335 μl
+ Đem trộn đều và điều chỉnh đến pH 8,0.
- Native Elution Buffer: 50 mM NaH2PO4, pH 8,0; 500 mM NaCl, 250 mM Imidazole.
* Hóa chất dùng cho điện di trên gel polyacrylamide
- Bis-acrylamide 30%, APS 10%, Glycerol 50%, TEMED. - Tris-HCl 1,5M (pH 8,8)
- Tris-HCl 0,5M (pH 6,8)
- Treatment buffer 6x: 7 ml Tris HCl pH 6,8; 3 ml glycerol 100 %; 1 g SDS, 1,2 mg bromophenol blue; 0,6 ml 2-mercapto ethanol.
- Dung dịch rửa 1: methanol 10 %, glacial acetic acid 10%, H2O 80%. - Dung dịch rửa 2: ethanol 35 %, glycerol 2 %, H2O 63 %.
- Công thức pha chế 1 bản gel polyacrylamide 12,6 % được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3. Công thức pha gel cô và gel tách
Thành phần Gel tách (4,5 ml) Gel cô (1ml)
H2O 0,55ml 0.45 ml
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Tris-HCl 0,5M (pH 6,8) 0,3 ml Glycerol 0,9 ml Bis/acrylamide 1,89 ml 0,14 ml SDS 10% 45 µl 4 µl APS 30 µl 8 µl TEMED 3 µl 1 µl
* Hóa chất dùng cho lai Western blot
- Dung dịch blotting 10 lần (1000 ml blotting 10x): 30,2 g Tris-base; 144,13 g glycine bổ sung H2O đến 1000 ml.
- Dung dịch blotting 1 lần (1000 ml blotting 1x): 100 ml blotting 10x, 200 ml methanol 100%, bổ sung H2O đến 1000 ml.
- Dung dịch TBS 2x (500 ml): 25 ml Tris-HCl 1M, 10 ml NaCl 5M, pH 7,5. - Dung dịch TBS 1x: 250 ml TBS 2x, 250 µl Tween 20%, bổ sung H2O đến 500 ml.
- Dung dịch phủ màng: sữa không béo (skim milk) 5% trong TBS 1x.
- Dung dịch kháng thể 1: kháng thể chuột kháng His tag của (Roche, Đức), kháng thể 1 được pha loãng 5000 lần trong sữa skim milk 5%.
- Dung dịch kháng thể 2: kháng thể thỏ kháng IgG chuột gắn alkaline phosphatase, kháng thể 2 được pha loãng 10000 lần trong sữa skim milk 5%.
- Dung dịch hiện màu alkaline: 0,75 ml dung dịch A + 0,75ml dung dịch B
* Hóa chất dùng để gắn kháng thể lên bề mặt hạt latex
- Hạt latex kích thước 1 μm
- Polylink Coupling Buffer, Polylink Wash/Storage Bufer, PolyLink EDAC (Carbodiimide) và một số hóa chất được cung cấp bởi hãng Bangslab (http://www.bangslabs.com).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Ampicillin (ROTH, Karl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, Đức). Carbenicillin (Duchefa).
2.2.2. Thiết bị máy móc
- Máy PCR PTC - 100 (MJ Research Inc, Mỹ) - Máy ly tâm các loại của hãng Sorvall (Mỹ). - Thiết bị điện di protein loại nhỏ.
- Bộ sắc ký để tinh sạch protein.
- Máy siêu âm để phá vỡ thành tế bào.
- Máy đo quang phổ NanoDrop Lite (Thermo Scientific)
- Bể ổn nhiệt, tủ ấm nuôi vi sinh vật, tủ cấy vô trùng, máy lắc và các trang thiết bị khác như: lam kính, kính hiển vi, máy chụp ảnh, pipet man... của phòng Công nghệ Tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng và phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, phòng Công nghệ ADN ứng dụng và phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phƣơng pháp biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng HB 2151 bằng sốc nhiệt
Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli HB 2151:
- Cấy chuyển 1 khuẩn lạc tế bào E. coli HB2151 vào 5 ml môi trường LB lỏng, nuôi 37oC, trên máy lắc 200 vòng/phút đến pha ổn định.
- Hút 2 ml dịch nuôi cấy cho vào 200 ml môi trường LB lỏng trong bình tam giác 500 ml, nuôi trên máy lắc ở cùng điều kiện, trong thời gian 2 – 3 giờ cho đến khi OD600đạt 0,6.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Chia dịch khuẩn ra ống falcon mỗi ống chứa 50ml dung dịch và giữ mẫu trong đá khoảng 15 phút.
- Ly tâm lạnh 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. - Thu cặn và hòa tan cặn trong dung dịch CaCl2 0,2 M.
- Tiếp tục lặp lại 2 lần bước ly tâm, thu và hòa tan cặn tế bào.
- Cặn tế bào được hòa vào 1 ml CaCl2 0,2 M lạnh, vô trùng có chứa 15% glyxerol, chia nhỏ ra các ống eppendorf (50 -70 μl) và đem cố định bằng Nitơ lỏng.
- Bảo quản tế bào khả biến ở tủ -85oC.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế vào bào khả biến E. coli HB 2151:
- Lấy tế bào khả biến từ tủ -85oC đặt trên đá trong 10 phút.
- Bổ sung 5 µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến. Trộn nhẹ, đặt trên đá 15 phút.
- Đặt vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC trong 70 giây. Đặt trong đá 5 phút. - Bổ sung 700 µl môi trường LB lỏng và lắc (200 vòng/phút) ở 370C trong vòng 1 giờ.
- Trải trên đĩa LB đặc có kháng sinh thích hợp.
2.3.2. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony PCR)
Kết quả của quá trình biến nạp là tập hợp các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc. Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc trắng, tiến hành phản ứng colony PCR với cặp mồi pTI2-NcoI-F và pTI2-NotI-R để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen mong muốn. Thành phần của phản ứng colony PCR được trình bày ở bảng 2.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sản phẩm của phản ứng Colony-PCR được điện di trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmid như mong muốn.
2.3.3. Phƣơng pháp biểu hiện kháng thể đơn chuỗiVH10 tái tổ hợp trong E. coli
- Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli HB2151 mang plasmid pTI2+/VH10 được nuôi trong ống Falcon 50 ml có chứa 5 ml môi truờng LB bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 100 µg/ml qua đêm (16-18h) ở 37oC, lắc 200 vòng/phút.
- Chuyển 1ml sinh khối dịch nuôi qua đêm vào bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 100 µg/ml.
- Nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,4 – 0,6. Bổ sung IPTG vào dịch nuôi cấy sao cho nồng độ cuối của IPTG là 1 mM, tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 4 giờ. Ly tâm 6000 vòng/phút, 10 phút, bỏ dịch nổi, thu sinh khối.
- Sinh khối tế bào E. coli HB2151 đã thu được rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X. - Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm.
- Điện di kiểm tra protein tổng số trên gel polyacrylamide 12,6 % để phát hiện sơ bộ protein tái tổ hợp.
2.3.4. Tối ƣu các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein VH10 ở E. coli
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và trạng thái biểu hiện của protein tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện. Đối với hệ thống biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, nhiệt độ cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng là những yếu tố tác động nhiều nhất đến sự biểu hiện của protein tái tổ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hợp. Để tối ưu các điều kiện cảm ứng biểu hiện, các thí nghiệm được bố trí bao gồm:
- Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu ở các ngưỡng: 22oC, 28oC, 30oC và 37oC. - Xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu ở các ngưỡng: 0,2 mM, 0,4 mM, 0,8 mM và 1 mM.
- Xác định thời gian cảm ứng tối ưu ở các ngưỡng: 1 h, 2 h, 3 h, 4 h và 5 h. Sau khi cảm ứng biểu hiện ở các điều kiện nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng khác nhau, tiến hành ly tâm thu tế bào và hòa lại trong đệm phá tế bào. Tế bào sau đó được phá bằng siêu âm trong 10 phút. Protein tái tổ hợp được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12,6 % để xác định các điều kiện tối ưu cho cảm ứng biểu hiện.
2.3.5. Phƣơng pháp tinh sạch kháng thể đơn chuỗi sử dụng sắc ký ái lực
Protein tái tổ hợp thu được dưới dạng dung hợp có His-tag, do đó được tinh sạch bằng cột ái lực Niken Resin trong bộ sinh phẩm Probond Nickel Chelating Resin (Invitrogen, Mỹ).
Đầu tiên, tế bào E. coli chủng HB 2151 mang vector tái tổ hợp được nuôi trong 100 đến 400 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin và chất cảm ứng IPTG trong các khoảng thời gian khác nhau trên máy lắc ở điều kiện lắc 200 vòng/ phút và nhiệt độ thay đổi từ 30oC đến 37oC. Để có thể giữ được hoạt tính của protein sau khi tinh sạch, protein được tinh sạch theo phương pháp Native Conditions. Quá trình tiến hành:
Chuẩn bị cột
- Lắc đều dung dịch ProBondTM Resin của bộ sinh phẩm.
- Lấy 2 ml dung dịch ProBond Resin vào một cột tinh sạch 10ml (kèm theo bộ sinh phẩm). Đảo đều và để cho Resin lắng xuống theo trọng lực, sau đó ly tâm với tốc độ 800 xg trong thời gian 1 phút. Hút bỏ dịch nổi.
- Bổ sung 6 ml nước vô trùng, lắc cho Resin tan đều, sau đó lại ly tâm 800xg trong 1 phút. Mở nắp đáy cho nước chảy qua.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Bổ sung 6 ml Native Binding Buffer
- Tiếp tục lắc nhẹ hòa tan Resin, ly tâm tốc độ 800 xg trong thời gian 1 phút, sau đó cho chảy hết.
Tinh sạch theo phƣơng pháp sắc ký ái lực sử dụng cột Nickel Protein - Ly tâm 5000 vòng/phút với thể tích 400 ml rồi tiến hành thu cặn. - Thêm 15 ml Binding Buffer và 8 g lysozyme.
- Để trong đá trong 15 phút.
- Tiến hành siêu âm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 20 giây/lần, nghỉ 20 giây trong 1 tiếng 30 phút.
- Chia nhỏ dung dịch ra các ống eppendorf rồi tiến hành ly tâm 13000 vòng/phút rồi thu dịch.
- Phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột ProBond Nickel-Chelating Resin đã chuẩn bị trước.
- Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ phòng để protein tái tổ hợp liên kết với Ni++.
- Các protein không có ái lực Ni++ sẽ bị đẩy ra khỏi cột bằng cách rửa cột nhiều lần bằng các buffer.
- Rửa bằng Native Binding Buffer 3 lần, mỗi lần 6 ml. - Rửa bằng Native Wash Buffer 3 lần, mỗi lần 3 ml.
- Protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột bằng Native Elution Buffer và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %.
2.3.6. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide
Các phân tử protein sau khi được biến tính sẽ tích cùng một loại điện tích nhờ SDS trong môi trường đệm SDS-PAGE. Dưới tác dụng của điện trường những phân tử này cùng di chuyển về một cực, phân tử nào có kích thước nhỏ (trọng lượng phân tử thấp) sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử có kích thước lớn (trọng lượng phân tử cao).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Chuẩn bị gel polyacrylamide 12,6 % với các thành phần ở bảng 2.3.bảng 2.4.
- Xử lý mẫu protein: các tế bào thu lại bằng ly tâm và được phá bằng đệm xử lý mẫu Treatment Buffer 6X và ủ ở 100oC để biến tính.
- Mẫu sau khi biến tính được làm lạnh nhanh trên đá. - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi
- Tra mẫu vào giếng và chạy với cường độ dòng điện ban đầu 12mA trong khoảng 30 phút sau đó tăng lên 22 mA và chạy tiếp khoảng 40-45 phút.
- Gỡ bản gel và nhuộm Coomassie brilliant: Rửa bằng dung dịch rửa 1 trong 10 phút Nhuộm coomassie trong vòng 30 phút Tẩy màu bằng dung dịch rửa 2.
2.3.5. Phƣơng pháp lai Western blot
Western blot là phương pháp lai miễn dịch dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể. Các protein sau khi điện di trên SDS-PAGE được chuyển sang màng Polyvinylidene difluoride (PVDF), vị trí không có protein được phủ bằng casein. Sau đó màng PVDF được phủ bằng kháng thể đặc hiệu với protein được gắn trên màng. Phức hệ protein-kháng thể được phát hiện thông qua một kháng kháng thể có gắn enzyme có tác dụng phân hủy cơ chất tạo màu.
Quy trình:
- Chạy điện di biến tính protein bằng SDS-PAGE với 2 bản gel một để nhuộm coomassie và một bản để thực hiện phản ứng lai Western blot.
- Gỡ bản gel chuyển sang bộ chuyển màng của hãng Bio-Rad có chứa màng PVDF và dung dịch Blotting 1X.
Thứ tự đặt như sau: tấm xốp + giấy thấm + gel + màng PVDF + giấy thấm + tấm xốp. Trong đó màng PVDF được xử lý trước trong dung dịch methanol 100% trong 10 phút, được tráng lại bằng đệm chuyển 1X.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Chạy Western blot với hiệu điện thế U = 100V (cường độ dòng điện 200- 250 mA) trong 2h, ở 4oC, khuấy từ nhẹ.
- Sau khi chạy xong lấy màng PVDF ra và tráng màng bằng nước khử ion 2 lần. - Phủ màng 2h ở 25oC bằng dung dịch sữa skim milk 5% trong đệm TBS 1X. - Rửa màng bằng TBS 1X, 3 lần, mỗi lần 5 phút.
- Phủ kháng thể 1 (kháng thể chuột kháng His tag). Kháng thể 1 được pha loãng 5000 lần trong sữa skim milk 5%, lắc ở nhiệt độ phòng trong 1h.
- Lặp lại 2 bước rửa như trên.
- Phủ kháng thể 2 (kháng thể thỏ kháng IgG chuột). Kháng thể 2 được pha loãng 10000 lần trong sữa skim milk 5% trong đệm TBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng trong 1h .
- Lặp lại 2 bước rửa như trên.
- Hiện màu trong dung dịch hiện màu alkaline. - Ủ màng, lắc ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
2.3.6. Phƣơng pháp đo nồng độ protein bằng máy đo quang phổ
Nguyên tắc của phương pháp đo nồng độ protein bằng máy đo quang phổ