Sau khi tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện kháng thể VH10, chúng tôi tiến hành tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10 với lượng lớn. Để thu được lượng protein cao nhất, protein VH10 được đánh giá tính tan bằng cách siêu âm phá vỡ tế bào, phần dịch nổi phía trên được thu lại, phần cặn được hòa tan trong đệm PBS chứa 5 M Urea. Ly tâm phần dịch nổi và kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %, kết quả cho thấy phần lớn protein tái tổ hợp nằm trong phần dịch tan (Hình 3.8)
Hình 3.8. Hình ảnh điện di kiểm tra tính tan của protein VH10
M: Thang protein chuẩn (Fermentas), Giếng 1: pha cặn, Giếng 2: pha dịch. Do protein VH10 được biểu hiện bằng vector pTI2+ nên protein tạo ra sẽ được dung hợp với 1 trình tự gồm 6 amino axit Histidin. Trình tự His-tag này sẽ giúp protein bám vào cột sắc ký ái lực trong quá trình tinh sạch. Với 300 ml dịch nuôi chứa chủng E. coli HB2151 đã cảm ứng IPTG 1mM, thời gian cảm ứng 5h, nhiệt độ 30oC sẽ được tinh sạch qua cột His tag để thu các phân đoạn khác nhau. Protein tinh sạch qua các phân đoạn được thu lại và được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12,6 % (Hình 3.9).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.9. Hình ảnh điện di protein VH10 sau khi tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực His-tag.
M: Thang protein chuẩn (Fermentas). Giếng 1, 2 lần lượt là các phân đoạn thu được khi tinh sạch.
Hình 3.9 cho thấy các phân đoạn thu được có duy nhất một băng có kích thước khoảng 24 kDa. Lượng protein này được định lượng bằng máy quang NanoDrop Lite (Thermo Scientific) cho kết quả 1,43 mg/ml. Như vậy, với 300 ml dịch nuôi, các điều kiện biểu hiện: IPTG 1 mM, thời gian cảm ứng 5h, nhiệt độ 30o
C chúng tôi thu được 1,43 mg/ml protein VH10 tinh sạch. Lượng protein này sẽ được dùng như một trong các nguyên liệu quan trọng cho việc tạo ra các bộ kit phát hiện virus cúm A/H5N1.