Trong nghiên cứu này, vector pTI2+ được sử dụng làm vector biểu hiện. Đoạn gen mã hóa cho kháng thể VH10 sẽ được chèn vào giữa vị trí promoter Lac và trình tự c-myc bằng cách sử dụng 2 loại enzyme giới hạn là NotI và NcoI. Trình tự His-tag mã hóa cho 6 amino axit histidin sẽ được biểu hiện và gắn vào đuôi -COOH của protein tái tổ hợp. Promoter Lac được thiết kế trong vector để biểu hiện tối ưu các protein ở E. coli. Trên vector pTI2+, trình tự amber nằm giữa trình tự c-myc và gIII đóng vai trò là stop codon khi biểu hiện trong tế bào
E. coli HB2151. Một đặc điểm khác của vector biểu hiện ở mức độ dịch mã so
với các vector biểu hiện ở mức độ phiên mã là phải có trình tự rbs (ribosome binding site-vị trí liên kết ribosome) được thiết kế ở giữa vị trí của promoter và đoạn gen được chèn vào. Ngoài ra, trên vector pTI2+ còn có trình tự mã hóa cho gen kháng kháng sinh Ampicillin đóng vai trò là gen chọn lọc. Trình tự khởi đầu sao chép ColEl và M13 giúp cho việc tích lũy một số lượng lớn các plasmid trong tế bào làm tăng mức độ biểu hiện protein.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sau khi tiến hành biến nạp vector pTI2+ chứa đoạn gen mã hóa cho kháng thể VH10 (đã được thiết kế và sàng lọc trên thư viện hình 2.1) vào tế bào khả biến E. coli chủng HB2151 bằng phương pháp sốc nhiệt và tiến hành chọn lọc dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp trên môi trường LB đặc có bổ sung Ampicillin 100 mg/l. Vector pTI2+ có chứa đoạn gen kháng kháng sinh Ampicillin nên khi vector này được biến nạp vào vi khuẩn E. coli thành công thì những tế bào chứa vector tái tổ hợp sẽ sống sót trên môi trường có Ampicillin. Còn những tế bào không nhận vector sẽ không mọc được trên đĩa LB có bổ sung Ampicillin.
Hình 3.1. Kết quả biến nạp vào tế bào E.coli HB 2151
Kết quả biến nạp cho thấy, trên đĩa LB đặc các khuẩn lạc trắng mọc riêng rẽ và có thể phân biệt bằng mắt thường. Như vậy, quá trình biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli đã thành công. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các khuẩn lạc trắng chỉ mới khẳng định trong tế bào vi khuẩn E. coli thu được có chứa vector pTI2+ còn vector pTI2+ đã chứa gen mã hóa cho kháng thể VH10 hay chưa thì chưa xác định được. Do đó chúng tôi tiến hành chọn dòng tế bào E. coli chứa vector tái tổ hợp.
Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen VH10 trong vector pTI2+, 5 dòng khuẩn lạc được chọn ngẫu nhiên và tiến hành PCR trực tiếp từ các khuẩn lạc này với cặp mồi đặc hiệu pTI-NcoI-F và pTI-NotI-R. Kết quả sản phẩm colony-PCR được điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra và được thể hiện trên hình 3.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR dùng mồi đặc hiệu (pTI- NcoI-F và pTI-NotI-R) từ dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc.
M: marker 1kb (Fermentas); (-): đối chứng âm (sử dụng khuẩn lạc không mang vector biểu hiện pTI2+); (+) đối chứng dương. Các giếng 1-5: Các dòng khuẩn lạc từ 1-5.
Kết quả thu được trên hình 3.2 cho thấy các dòng khuẩn lạc số 2, 3, 5 cho băng điện di có kích thước mong muốn khoảng 736 bp, tương ứng với kích thước gen mã hóa cho kháng thể VH10, trong khi 2 dòng khuẩn lạc số 1 và số 4 không xuất hiện băng. Điều này chứng tỏ 3 dòng khuẩn lạc số 2, 3 và 5 đều chứa plasmid tái tổ hợp pTI2+/VH10. Như vậy có thể khẳng định vector pTI2+/VH10 đã được biến nạp thành công vào vi khuẩn E. coli chủng HB2151. Chúng tôi chọn dòng khuẩn lạc số 2 để tiến hành biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10.
Để biểu hiện protein tái tổ hợp, chúng tôi sử dụng chủng vi khuẩn E.coli
HB 2151 do có chu kỳ sống ngắn, dễ dàng biến nạp và đã được biến đổi để tăng cường khả năng biểu hiện. Gen mã hóa cho kháng thể VH10 trong vector tái tổ hợp pTI2+ được hoạt động dưới sự điều khiển của promoter Lac. Promoter này được kiểm soát chặt chẽ bởi chất cảm ứng IPTG. Vì vậy, để nghiên cứu khả năng biểu hiện của protein VH10, các thể biến nạp được nuôi cấy trong môi trường chọn lọc có chất cảm ứng là IPTG.
Sau khi xác định được các dòng khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa gen mong muốn, dòng khuẩn lạc số 2 được nuôi trong môi trường LB lỏng đến khi OD600đạt 0,4 đến 0,6 thì bổ sung thêm chất cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cùng là 1mM và nuôi tiếp trong thời gian 4 giờ. Do tế bào E. coli HB2151 có khả năng biểu hiện kháng thể VH10 dưới dạng tan, vì vậy tế bào vi khuẩn sau cảm ứng được phá vỡ bằng siêu âm, kháng thể trong dung dịch đệm sẽ được phân tách với cặn tế bào bằng ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 5 phút. Protein tổng số được điện di kiểm tra trên trên gel polyacrylamide để phát hiện sơ bộ protein tái tổ hợp. Kết quả được trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di protein tổng số của tế bào E. coli HB2151 mang gen mã hóa cho các cấu trúc kháng thể đơn chuỗi VH10
M: Thang protein chuẩn (Fermentas); Giếng 1: Protein tổng số tách từ dòng khuẩn lạc số 2 không cảm ứng bằng IPTG; Giếng 2: Pha dịch chứa protein hòa tan của dòng khuẩn lạc số 2 được cảm ứng bằng IPTG trong 4h.
Kết quả thu được trên hình 3.3 cho thấy, phân đoạn protein thu được ở giếng thứ 2 có kích thước khoảng 24 kDa tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết của protein VH10, trong khi đó phân đoạn này không thu được ở mẫu không cảm ứng bằng IPTG (giếng 1). Điều này có thể giải thích là do trong điều kiện có chất cảm ứng IPTG, protein repressor bám vào vị trí operator ngăn cản RNA polymerase bám vào promoter. Khi cảm ứng bằng IPTG, chất này sẽ tương tác với protein repressor làm cho nó không gắn được vào operator, promoter Lac không bị ức chế, protein VH10 tái tổ hợp được tổng hợp. Như vậy, bước đầu có thể khẳng định kháng thể VH10 tái tổ hợp đã được biểu hiện thành công trong tế bào vi khuẩn E. coli HB2151.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Theo thiết kế vector biểu hiện pTI2+/VH10, khi protein VH10 được tổng hợp, nó sẽ nối thêm 6 amino axit Histidin ở phần COOH. Đây là một đặc điểm thuận lợi cho việc tinh sạch sản phẩm sau này, đồng thời cũng là một tín hiệu để nhận biết sản phẩm được tổng hợp bằng Western blot. Bởi vậy để khẳng định sản phẩm protein biểu hiện được là của gen VH10, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phương pháp Western blot với kháng thể là anti polyhistidin. Kết quả thu được trình bày ở hình 3.4.
Hình 3.4. Kết quả lai Western blot kiểm tra protein tổng số của tế bào E. coli HB2151 mang vector pTI2+/VH10 với kháng thể anti polyhistidin.
M: Thang protein chuẩn (Fermentas). Giếng 1: protein đối p66 của E. coli Rosetta- gami. Giếng 2: protein VH10 của dòng khuẩn lạc số 2.
Kết quả thu được trên hình 3.4 cho thấy trên giếng 1 xuất hiện băng protein kích thước khoảng 66 kDa tương ứng với kích thước của đối chứng dương (protein p66), điều này chứng tỏ phản ứng Western blot được thực hiện thành công. Trên giếng 2 xuất hiện một băng protein và có kích thước khoảng 24 kDa tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ có liên kết đặc hiệu giữa protein này với kháng thể anti polyhistidin. Như vậy, protein VH10 được tổng hợp thành công trong chủng E. coli HB2151 dưới sự điều kiển của promoter Lac được cảm ứng bởi IPTG.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.1.2. Tối ƣu các điều kiện biểu hiện kháng thể đơn chuỗi VH10
Sự biểu hiện protein tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện là vi khuẩn E. coli
phụ thuộc rất nhiều yếu tố môi trường, cho nên việc xác định được điều kiện tối ưu cho biểu hiện protein quan tâm là điều quan trọng. Để xác định được điều kiện tối ưu đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm biểu hiện trong các điều kiện nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng khác nhau.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thông thường, nhiệt độ thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào vi khuẩn E. coli là ở 37oC. Tuy nhiên, đối với protein tái tổ hợp thường bị ức chế bởi các protein vật chủ, hoặc bị phân hủy bởi nhiệt độ cao hoặc gây độc với tế bào vật chủ. Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng tổng hợp protein VH10 tái tổ hợp ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 22oC, 28oC, 30oC và 37oC với cùng nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM và thời gian cảm ứng 4 giờ. Protein tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %. Kết quả được trình bày trên hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di protein VH10 được biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau.
M: Thang protein chuẩn (Fermentas). Giếng 1: Không cảm ứng biểu hiện ở nhiệt độ 22oC. Giếng 2: Cảm ứng biểu hiện ở nhiệt độ 22oC. Giếng 3: Không cảm ứng biểu hiện ở nhiệt độ 28oC. Giếng 4: Cảm ứng biểu hiện ở nhiệt độ 28oC. Giếng 5: Không cảm ứng biểu hiện ở nhiệt độ 30oC. Giếng 6: Cảm ứng biểu hiện ở nhiệt độ 30o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Giếng 7: Không cảm ứng biểu hiện ở nhiệt độ 37oC. Giếng 8: Cảm ứng biểu hiện ở nhiệt độ 37o
C.
Kết quả thu được trên hình 3.5 cho thấy ở giếng 6 cho băng protein VH10 đậm nhất. Chứng tỏ protein VH10 tái tổ hợp được tổng hợp tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 30oC. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ cảm ứng là 30o
C cho các nghiên cứu tiếp theo.
Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG
Sự cảm ứng biểu hiện mỗi loại protein chỉ thích hợp ở nồng độ IPTG nhất định. Do đó việc xác định được nồng độ IPTG tối ưu cho quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp là cần thiết và có ý nghĩa thực tế trong quá trình sản xuất lượng lớn.
Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng biểu hiện của protein VH10 tái tổ hợp ở các nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau từ 0,2 – 1 mM (0,2 mM; 0,4 mM; 0,8 mM và 1 mM) ở 30oC và thu mẫu sau 3 giờ cảm ứng. Kết quả chạy điện di protein tổng số kiểm tra trên gel polyacrylmide 12,6 % được trình bày ở hình 3.6.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di protein VH10 được cảm ứng biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác nhau
M: Thang protein chuẩn (Fermentas). Protein tổng số của E. coli HB2151 không mang plasmid pTI2+/VH10. Giếng 2: Protein tổng số của E. coli HB2151 mang plasmid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
pTI2+/VH10 không cảm ứng bằng IPTG. Giếng 3-6: Nồng độ chất cảm ứng IPTG: 0,2 mM; 0,4 mM; 0,8 mM; 1 mM tương ứng.
Kết quả trên hình 3.6 cho thấy, ở giếng 6 lượng protein VH10 tái tổ hợp được tổng hợp nhiều nhất tương ứng với nồng độ chất cảm ứng IPTG 1 mM. Như vậy, chúng tôi chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM cho nghiên cứu tiếp theo.
Ảnh hƣởng của thời gian cảm ứng
Thời gian cảm ứng có liên quan chặt chẽ đến số lượng và chất lượng của protein tái tổ hợp được biểu hiện. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát các thời điểm thu mẫu khác nhau từ 1 giờ đến 5 giờ sau khi bổ sung chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1 mM và nhiệt độ 30oC. Protein tổng số ở các giai đoạn được kiểm tra trên gel điện di polyacrylamide 12,6 % và thể hiện trên hình 3.7.
Hình 3.7. Hình ảnh điện di protein VH10 được cảm ứng biểu hiện ở các thời gian khác nhau
M: Thang protein chuẩn (Fermentas). Giếng 1: Protein tổng số của E. coli không mang plasmid pTI2+/VH10. Giếng 2: Protein tổng số của E. coli HB2151 mang plasmid pTI2+/VH10 không cảm ứng bằng IPTG. Giếng 3-7: Protein tổng số của E. coli
HB2151 mang plasmid pTI2+/VH10 được cảm ứng IPTG với thời gian tương ứng từ 1 giờ đến 5 giờ.
Kết quả hình 3.7 cho thấy ở giếng 7 băng protein tái tổ hợp biểu hiện được là một băng đậm, rõ nét hơn so với các giếng khác. Từ kết quả này, chúng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
tôi lựa chọn khoảng thời gian cảm ứng là 5 giờ cho các quá trình tổng hợp protein VH10.
Như vậy, điều kiện tối ưu để cảm ứng biểu hiện protein VH10 trong chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli HB2151 là ở nhiệt độ 30oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 1mM sau 5 giờ cảm ứng.
3.1.3. Tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10
Sau khi tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện kháng thể VH10, chúng tôi tiến hành tinh sạch kháng thể đơn chuỗi VH10 với lượng lớn. Để thu được lượng protein cao nhất, protein VH10 được đánh giá tính tan bằng cách siêu âm phá vỡ tế bào, phần dịch nổi phía trên được thu lại, phần cặn được hòa tan trong đệm PBS chứa 5 M Urea. Ly tâm phần dịch nổi và kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %, kết quả cho thấy phần lớn protein tái tổ hợp nằm trong phần dịch tan (Hình 3.8)
Hình 3.8. Hình ảnh điện di kiểm tra tính tan của protein VH10
M: Thang protein chuẩn (Fermentas), Giếng 1: pha cặn, Giếng 2: pha dịch. Do protein VH10 được biểu hiện bằng vector pTI2+ nên protein tạo ra sẽ được dung hợp với 1 trình tự gồm 6 amino axit Histidin. Trình tự His-tag này sẽ giúp protein bám vào cột sắc ký ái lực trong quá trình tinh sạch. Với 300 ml dịch nuôi chứa chủng E. coli HB2151 đã cảm ứng IPTG 1mM, thời gian cảm ứng 5h, nhiệt độ 30oC sẽ được tinh sạch qua cột His tag để thu các phân đoạn khác nhau. Protein tinh sạch qua các phân đoạn được thu lại và được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12,6 % (Hình 3.9).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.9. Hình ảnh điện di protein VH10 sau khi tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực His-tag.
M: Thang protein chuẩn (Fermentas). Giếng 1, 2 lần lượt là các phân đoạn thu được khi tinh sạch.
Hình 3.9 cho thấy các phân đoạn thu được có duy nhất một băng có kích thước khoảng 24 kDa. Lượng protein này được định lượng bằng máy quang NanoDrop Lite (Thermo Scientific) cho kết quả 1,43 mg/ml. Như vậy, với 300 ml dịch nuôi, các điều kiện biểu hiện: IPTG 1 mM, thời gian cảm ứng 5h, nhiệt độ 30o
C chúng tôi thu được 1,43 mg/ml protein VH10 tinh sạch. Lượng protein này sẽ được dùng như một trong các nguyên liệu quan trọng cho việc tạo ra các bộ kit phát hiện virus cúm A/H5N1.
3.2. Thử nghiệm tạo kit phát hiện nhanh cúm A/H5N1 theo nguyên lý ngƣng kết miễn dịch ngƣng kết miễn dịch
3.2.1. Chuẩn hóa lƣợng kháng thể gắn lên bề mặt hạt latex
Quá trình gắn kháng thể đơn chuỗi lên bề mặt hạt latex phụ thuộc rất nhiều yếu tố như dung dịch đệm, nồng độ và tính chất của protein, pH... Trong đó, lượng protein đóng một vai trò quan trọng vì khả năng ngưng kết chỉ có thể xảy ra khi số phân tử protein được gắn lên bề mặt hạt latex phải đủ lớn.
Theo tính toán hiện tượng ngưng kết chỉ có thể quan sát bằng mắt thường khi có 100 đám tủa được tạo thành, mỗi đám tủa có kích thước 50 mm và được tạo thành từ 105
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thể. Do đó, số phân tử kháng nguyên cần có để phát hiện được bằng phản ứng ngưng kết là khoảng 100x105
x10=108 phân tử [72].
Để có thể tìm được nồng độ kháng thể thích hợp nhất, chúng tôi tiến hành