Về cơ bản, để tạo ra thư viện kháng thể cần khuếch đại các đoạn gen chuỗi nặng và chuỗi nhẹ từ mô bạch huyết hoặc lympho bào máu ngoại biên bằng phiên mã ngược và PCR. Cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn và tách dòng vào vector phagemid để có thể biểu hiện khi dung hợp với protein của phage [45]. Tất cả các protein vỏ trong của phage đã được sử dụng cho mục đích display. Cách tiếp cận phổ biến nhất với peptide display là dung hợp các peptide ngoại lai với đầu N của pIII hoặc pVIII, trong khi các protein thường được gắn với pIII. Peptide và protein dung hợp với đầu N của pVII [31], pIX
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
[32] cũng như với đầu C của pVI [41], pVIII [63], và pIII nhân tạo đã được công bố [30]. Điều này có thể được làm bằng hai bước tách dòng sử dụng một số enzyme giới hạn hoặc bởi dung hợp các đoạn chuỗi nặng và nhẹ đã khuếch đại bằng PCR. Bước lắp ghép này cùng với việc sử dụng enzyme giới hạn hiếm SfiI, cho phép tách dòng theo một chiều duy nhất [20]. Sau đó biến nạp thư viện phagemid chứa kháng thể vào E. coli [45].
Để bộc lộ các peptide hoặc protein sử dụng hệ thống phagemid, helper phage được bổ sung vào vi khuẩn mang DNA phagemid để tạo ra hạt virus sử dụng trong sàng lọc. Khi nhiễm vào vi khuẩn mang phagemid, bộ gen của helper phage bắt đầu tổng hợp tất cả các protein của phage kiểu dại. Khi DNA phagemid mang promoter phage ngược dòng trình tự mã hóa protein dung hợp, protein này cũng được tổng hợp và gắn với protein của phage. Khi quá trình lắp ráp phage bắt đầu, các virion ưu tiên sử dụng DNA phagemid hơn là DNA của helper phage vì nó mang tín hiệu đóng gói đầy đủ chức năng. Các hạt phage được tiết ra sẽ bộc lộ trình tự ngoại lai trên protein vỏ và mang phagemid mã hóa trình tự này [20].
Tạo được thư viện việc sàng lọc là hết sức quan trọng. Hầu hết các bước sàng lọc dựa trên nguyên lý chọn lọc ái lực bao gồm các bước:
- Khuếch đại thư viện và tạo phage. - Cho phage tiếp xúc với đích.
- Loại bỏ phage không gắn bằng cách rửa
- Tách phage gắn và tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ để khuếch đại chúng lên.
Sau khi khuếch đại thư viện và tạo phage với các đoạn kháng thể ngẫu nhiên được biểu hiện trên bề mặt của nó, cần cho hỗn hợp phage này tiếp xúc với phân tử đích (kháng nguyên đích) nhằm sàng lọc dòng phage có ái lực gắn tốt nhất với phân tử đích. Để làm được điều này, cần cố định kháng nguyên đích. Rất nhiều phương pháp cố định kháng nguyên đã được phát triển cho kỹ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thuật phage display. Cách đơn giản và thường được sử dụng nhất là cố định các phân tử đích trên giá thể và cho dung dịch chứa phage đi qua. Trong kỹ thuật phage display, cần dùng thư viện có độ đa dạng càng cao càng tốt [44]. Thông thường, thư viện phage được giữ dưới dạng phagemid nằm trong tế bào chủ là E. coli. Do đó, bước khuếch đại này thực chất là khuếch đại tế bào E. coli.
Chất lượng thư viện phage display có thể được kiểm tra theo các thông số sau: - Số lượng các dòng chứa phagemid mang đoạn scFv.
- Số lượng dòng biểu hiện phage mang scFv. - Số lượng dòng biểu hiện kháng thể scFv hòa tan.
Một số thư viện phage display đã được tạo ra và sử dụng phổ biến như thư viện Nissim, được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Winter tại Cambridge (1994), thư viện của de Kruif và cộng sự (1995) và bật nhất là thư viện tổng hợp Fab và scFv do Griffiths và cộng sự tạo ra năm 1993 [29], [64], [34].