2.3.1. Phƣơng pháp biến nạp vào vi khuẩn E. coli chủng HB 2151 bằng sốc nhiệt
Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli HB 2151:
- Cấy chuyển 1 khuẩn lạc tế bào E. coli HB2151 vào 5 ml môi trường LB lỏng, nuôi 37oC, trên máy lắc 200 vòng/phút đến pha ổn định.
- Hút 2 ml dịch nuôi cấy cho vào 200 ml môi trường LB lỏng trong bình tam giác 500 ml, nuôi trên máy lắc ở cùng điều kiện, trong thời gian 2 – 3 giờ cho đến khi OD600đạt 0,6.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Chia dịch khuẩn ra ống falcon mỗi ống chứa 50ml dung dịch và giữ mẫu trong đá khoảng 15 phút.
- Ly tâm lạnh 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. - Thu cặn và hòa tan cặn trong dung dịch CaCl2 0,2 M.
- Tiếp tục lặp lại 2 lần bước ly tâm, thu và hòa tan cặn tế bào.
- Cặn tế bào được hòa vào 1 ml CaCl2 0,2 M lạnh, vô trùng có chứa 15% glyxerol, chia nhỏ ra các ống eppendorf (50 -70 μl) và đem cố định bằng Nitơ lỏng.
- Bảo quản tế bào khả biến ở tủ -85oC.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế vào bào khả biến E. coli HB 2151:
- Lấy tế bào khả biến từ tủ -85oC đặt trên đá trong 10 phút.
- Bổ sung 5 µl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến. Trộn nhẹ, đặt trên đá 15 phút.
- Đặt vào bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC trong 70 giây. Đặt trong đá 5 phút. - Bổ sung 700 µl môi trường LB lỏng và lắc (200 vòng/phút) ở 370C trong vòng 1 giờ.
- Trải trên đĩa LB đặc có kháng sinh thích hợp.
2.3.2. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony PCR)
Kết quả của quá trình biến nạp là tập hợp các khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc. Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc trắng, tiến hành phản ứng colony PCR với cặp mồi pTI2-NcoI-F và pTI2-NotI-R để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen mong muốn. Thành phần của phản ứng colony PCR được trình bày ở bảng 2.2.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sản phẩm của phản ứng Colony-PCR được điện di trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmid như mong muốn.
2.3.3. Phƣơng pháp biểu hiện kháng thể đơn chuỗiVH10 tái tổ hợp trong E. coli
- Khuẩn lạc của vi khuẩn E. coli HB2151 mang plasmid pTI2+/VH10 được nuôi trong ống Falcon 50 ml có chứa 5 ml môi truờng LB bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 100 µg/ml qua đêm (16-18h) ở 37oC, lắc 200 vòng/phút.
- Chuyển 1ml sinh khối dịch nuôi qua đêm vào bình tam giác 250 ml có chứa 100 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin nồng độ 100 µg/ml.
- Nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC cho đến khi OD600 đạt 0,4 – 0,6. Bổ sung IPTG vào dịch nuôi cấy sao cho nồng độ cuối của IPTG là 1 mM, tiếp tục nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 4 giờ. Ly tâm 6000 vòng/phút, 10 phút, bỏ dịch nổi, thu sinh khối.
- Sinh khối tế bào E. coli HB2151 đã thu được rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X. - Phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm.
- Điện di kiểm tra protein tổng số trên gel polyacrylamide 12,6 % để phát hiện sơ bộ protein tái tổ hợp.
2.3.4. Tối ƣu các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein VH10 ở E. coli
Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và trạng thái biểu hiện của protein tái tổ hợp trong các hệ thống biểu hiện. Đối với hệ thống biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, nhiệt độ cảm ứng, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng là những yếu tố tác động nhiều nhất đến sự biểu hiện của protein tái tổ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
hợp. Để tối ưu các điều kiện cảm ứng biểu hiện, các thí nghiệm được bố trí bao gồm:
- Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu ở các ngưỡng: 22oC, 28oC, 30oC và 37oC. - Xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu ở các ngưỡng: 0,2 mM, 0,4 mM, 0,8 mM và 1 mM.
- Xác định thời gian cảm ứng tối ưu ở các ngưỡng: 1 h, 2 h, 3 h, 4 h và 5 h. Sau khi cảm ứng biểu hiện ở các điều kiện nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG và thời gian cảm ứng khác nhau, tiến hành ly tâm thu tế bào và hòa lại trong đệm phá tế bào. Tế bào sau đó được phá bằng siêu âm trong 10 phút. Protein tái tổ hợp được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12,6 % để xác định các điều kiện tối ưu cho cảm ứng biểu hiện.
2.3.5. Phƣơng pháp tinh sạch kháng thể đơn chuỗi sử dụng sắc ký ái lực
Protein tái tổ hợp thu được dưới dạng dung hợp có His-tag, do đó được tinh sạch bằng cột ái lực Niken Resin trong bộ sinh phẩm Probond Nickel Chelating Resin (Invitrogen, Mỹ).
Đầu tiên, tế bào E. coli chủng HB 2151 mang vector tái tổ hợp được nuôi trong 100 đến 400 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin và chất cảm ứng IPTG trong các khoảng thời gian khác nhau trên máy lắc ở điều kiện lắc 200 vòng/ phút và nhiệt độ thay đổi từ 30oC đến 37oC. Để có thể giữ được hoạt tính của protein sau khi tinh sạch, protein được tinh sạch theo phương pháp Native Conditions. Quá trình tiến hành:
Chuẩn bị cột
- Lắc đều dung dịch ProBondTM Resin của bộ sinh phẩm.
- Lấy 2 ml dung dịch ProBond Resin vào một cột tinh sạch 10ml (kèm theo bộ sinh phẩm). Đảo đều và để cho Resin lắng xuống theo trọng lực, sau đó ly tâm với tốc độ 800 xg trong thời gian 1 phút. Hút bỏ dịch nổi.
- Bổ sung 6 ml nước vô trùng, lắc cho Resin tan đều, sau đó lại ly tâm 800xg trong 1 phút. Mở nắp đáy cho nước chảy qua.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Bổ sung 6 ml Native Binding Buffer
- Tiếp tục lắc nhẹ hòa tan Resin, ly tâm tốc độ 800 xg trong thời gian 1 phút, sau đó cho chảy hết.
Tinh sạch theo phƣơng pháp sắc ký ái lực sử dụng cột Nickel Protein - Ly tâm 5000 vòng/phút với thể tích 400 ml rồi tiến hành thu cặn. - Thêm 15 ml Binding Buffer và 8 g lysozyme.
- Để trong đá trong 15 phút.
- Tiến hành siêu âm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 20 giây/lần, nghỉ 20 giây trong 1 tiếng 30 phút.
- Chia nhỏ dung dịch ra các ống eppendorf rồi tiến hành ly tâm 13000 vòng/phút rồi thu dịch.
- Phần dịch nổi có chứa protein tái tổ hợp được đưa lên cột ProBond Nickel-Chelating Resin đã chuẩn bị trước.
- Lắc nhẹ cột trên máy vortex trong thời gian 15 phút ở nhiệt độ phòng để protein tái tổ hợp liên kết với Ni++.
- Các protein không có ái lực Ni++ sẽ bị đẩy ra khỏi cột bằng cách rửa cột nhiều lần bằng các buffer.
- Rửa bằng Native Binding Buffer 3 lần, mỗi lần 6 ml. - Rửa bằng Native Wash Buffer 3 lần, mỗi lần 3 ml.
- Protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột bằng Native Elution Buffer và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %.
2.3.6. Phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide
Các phân tử protein sau khi được biến tính sẽ tích cùng một loại điện tích nhờ SDS trong môi trường đệm SDS-PAGE. Dưới tác dụng của điện trường những phân tử này cùng di chuyển về một cực, phân tử nào có kích thước nhỏ (trọng lượng phân tử thấp) sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử có kích thước lớn (trọng lượng phân tử cao).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Chuẩn bị gel polyacrylamide 12,6 % với các thành phần ở bảng 2.3.bảng 2.4.
- Xử lý mẫu protein: các tế bào thu lại bằng ly tâm và được phá bằng đệm xử lý mẫu Treatment Buffer 6X và ủ ở 100oC để biến tính.
- Mẫu sau khi biến tính được làm lạnh nhanh trên đá. - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi
- Tra mẫu vào giếng và chạy với cường độ dòng điện ban đầu 12mA trong khoảng 30 phút sau đó tăng lên 22 mA và chạy tiếp khoảng 40-45 phút.
- Gỡ bản gel và nhuộm Coomassie brilliant: Rửa bằng dung dịch rửa 1 trong 10 phút Nhuộm coomassie trong vòng 30 phút Tẩy màu bằng dung dịch rửa 2.
2.3.5. Phƣơng pháp lai Western blot
Western blot là phương pháp lai miễn dịch dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể. Các protein sau khi điện di trên SDS-PAGE được chuyển sang màng Polyvinylidene difluoride (PVDF), vị trí không có protein được phủ bằng casein. Sau đó màng PVDF được phủ bằng kháng thể đặc hiệu với protein được gắn trên màng. Phức hệ protein-kháng thể được phát hiện thông qua một kháng kháng thể có gắn enzyme có tác dụng phân hủy cơ chất tạo màu.
Quy trình:
- Chạy điện di biến tính protein bằng SDS-PAGE với 2 bản gel một để nhuộm coomassie và một bản để thực hiện phản ứng lai Western blot.
- Gỡ bản gel chuyển sang bộ chuyển màng của hãng Bio-Rad có chứa màng PVDF và dung dịch Blotting 1X.
Thứ tự đặt như sau: tấm xốp + giấy thấm + gel + màng PVDF + giấy thấm + tấm xốp. Trong đó màng PVDF được xử lý trước trong dung dịch methanol 100% trong 10 phút, được tráng lại bằng đệm chuyển 1X.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Chạy Western blot với hiệu điện thế U = 100V (cường độ dòng điện 200- 250 mA) trong 2h, ở 4oC, khuấy từ nhẹ.
- Sau khi chạy xong lấy màng PVDF ra và tráng màng bằng nước khử ion 2 lần. - Phủ màng 2h ở 25oC bằng dung dịch sữa skim milk 5% trong đệm TBS 1X. - Rửa màng bằng TBS 1X, 3 lần, mỗi lần 5 phút.
- Phủ kháng thể 1 (kháng thể chuột kháng His tag). Kháng thể 1 được pha loãng 5000 lần trong sữa skim milk 5%, lắc ở nhiệt độ phòng trong 1h.
- Lặp lại 2 bước rửa như trên.
- Phủ kháng thể 2 (kháng thể thỏ kháng IgG chuột). Kháng thể 2 được pha loãng 10000 lần trong sữa skim milk 5% trong đệm TBS 1X, lắc ở nhiệt độ phòng trong 1h .
- Lặp lại 2 bước rửa như trên.
- Hiện màu trong dung dịch hiện màu alkaline. - Ủ màng, lắc ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
2.3.6. Phƣơng pháp đo nồng độ protein bằng máy đo quang phổ
Nguyên tắc của phương pháp đo nồng độ protein bằng máy đo quang phổ là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280 nm do có các axit amin như tryptophan, tyrosine và phenylalanine trong thành phần. Độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm thay đổi tùy loại protein nhưng hệ số tắt đo được (nghĩa là độ hấp thụ của dung dịch protein 1 % với đường truyền sóng 1 cm) cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch.
Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loại protein nào mà không biết hệ số tắt thì nồng độ protein được tính như sau:
Nồng độ protein (mg/ml) = A/Ɛ*l Trong đó: A là độ hấp thụ của mẫu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
l là đường truyền sóng trong 1 cm
Protein sau khi tinh sạch sẽ được đo nồng độ trên máy đo quang phổ NanoDrop Lite (Thermo Scientific). Các bước tiến hành:
- Chọn chế độ đo Protein từ màn hình Home screen sau đó chọn kiểu đo 1A/cm = 1 mg/ml.
- Đặt chế độ blank bằng cách hút 2 µl dung dịch đệm pha mẫu, nhả vào giữa bệ đo và đậy nắp lại. Sau đó nhấn nút Blank. Thấm khô dung dịch ở mắt đo và bệ đo. Lặp lại bước này 2 lần.
- Sau khi đặt xong chế độ Blank. Tiến hành đo nồng độ protein ở các mẫu bằng cách hút 2 µl dung dịch mẫu, nhả vào giữa bệ đo, đậy nắp lại và nhấn nút Measure. Ghi lại thông số giá trị nồng độ protein ở màn hình máy quang phổ.
2.3.7. Phƣơng pháp chế tạo bộ kit phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 dựa trên tính ngƣng kết của hạt latex đã gắn protein lên bề mặt
2.3.7.1. Phương pháp gắn kháng thể đơn chuỗi tái tổ hợp lên bề mặt hạt latex
Để có thể gắn protein vào hạt latex, trước tiên phải hoạt hóa các nhóm carboxyl (COOH) trên bề mặt hạt latex với EDAC (1-Ethyl-3-(3- Dimethylaminopropyl) carbodiimide) hòa tan trong nước. EDAC phản ứng với nhóm COOH để tạo hợp chất trung gian (ester hoạt động), chất này sẽ tương tác với nhóm amin bậc 1 trong phân tử protein đích (Hình 2.2)
Hình 2.2. Quy trình gắn protein lên bề mặt hạt latex [6].
Protein tái tổ hợp VH10 với các hàm lượng 100, 200 và 400 µg lần lượt được gắn lên 12,5 mg hạt latex để chọn lượng protein tối ưu. Quy trình chi tiết
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
gắn protein nghiên cứu vào hạt được tiến hành theo hướng dẫn đi kèm của công ty Bangslabs, gồm các bước:
- Làm ấm hạt latex, Poly Link Coupling Buffer và Poly Link wash/storage Buffer đến nhiệt độ phòng.
- Hút 12,5 mg hạt latex vào ống 1,5 - 2 ml.
- Ly tâm 5 - 10 phút ở 500 - 1000 vòng/phút rồi thu cặn. Chú ý thời gian ly tâm phụ thuộc vào kích thước của hạt.
- Hòa tan hạt trong 0,4 ml Poly Link Coupling Buffer. - Ly tâm 500 - 1000 vòng/ phút trong 5 phút rồi thu cặn. - Hòa tan cặn trong 0,17 ml Poly Link Coupling Buffer.
- Trước khi sử dụng, chuẩn bị 200 mg/ml EDAC = 10 mg Poly Link EDAC trong 50 μL Poly Link Coupling Bufer. Sử dụng ngay lập tức. Chú ý EDAC dạng dung dịch rất dễ phân hủy.
- Thêm 20 μl EDAC vào dịch cặn tại bước 6. - Đảo đều hoặc vortex nhẹ.
- Thêm protein tương đương 100 µg, 200 µg và 400 µg. Đảo nhẹ. Chú ý, lượng protein gắn vào hạt phụ thuộc vào nồng độ của protein trong dung dịch và kích thước của hạt (kích thước hạt < 1μm thì tỷ lệ bám vào protein / bề mặt càng lớn).
- Ủ từ 30 phút đến 1 tiếng tại nhiệt độ phòng và đảo nhẹ. Chú ý đảo đều xuống là tốt nhất, thời gian ủ càng dài thì độ bám dính càng tốt (sự bám dính của protein chủ yếu diễn ra ở 30 phút đầu tiên).
- Ly tâm 500 – 1000 vòng/phút trong vòng 10 phút rồi thu dịch cặn. - Hòa tan cặn trong 0,4 ml Poly Link wash/Storage buffer.
- Ủ hạt ở 4oC trong Poly Link wash/Storage buffer .
2.3.7.2. Phương pháp thử nghiệm bộ kit latex với các mẫu thực địa
Kit chẩn đoán virus cúm A/H5N1 được kiểm tra khả năng phát hiện virus cúm A/H5N1 với 20 mẫu thu ngoài thực địa (Bảng 2.1) gồm 8 mẫu dịch nghiền từ mô và não của gia cầm nhiễm bệnh và 12 mẫu được thu từ dịch ngoáy hầu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
họng. Trong đó, 4 mẫu âm tính và 16 mẫu dương tính với phương pháp Real time PCR.
Kết quả chẩn đoán virus H5N1 của bộ kit latex được so sánh với kết quả của phương pháp Real time PCR và phương pháp ngưng kết hồng cầu (Haemagglutination test - HA) [16]. Phương pháp ngưng kết hồng cầu được tiến hành gồm các bước:
- Chia 25 µl PBS vào từng giếng của phiến plastic có giếng đáy hình V. - Cho 25 µl dịch chứa virus vào giếng đầu tiên. Để xác định chính xác ngưng kết hồng cầu, dịch chứa này phải gần với giới hạn của một chuỗi pha loãng ban đầu, tức là 1/3, 1/4, 1/5, 1/6…
- Tạo các độ pha loãng gấp đôi của các thể tích 25 µl của dịch chứa virus H5N1 trên phiến.
- Cho thêm 25 µl đệm PBS vào từng giếng.
- Cho 25 µl dịch chứa hồng cầu gà 1% (v/v) vào từng giếng.