ngƣng kết miễn dịch
3.2.1. Chuẩn hóa lƣợng kháng thể gắn lên bề mặt hạt latex
Quá trình gắn kháng thể đơn chuỗi lên bề mặt hạt latex phụ thuộc rất nhiều yếu tố như dung dịch đệm, nồng độ và tính chất của protein, pH... Trong đó, lượng protein đóng một vai trò quan trọng vì khả năng ngưng kết chỉ có thể xảy ra khi số phân tử protein được gắn lên bề mặt hạt latex phải đủ lớn.
Theo tính toán hiện tượng ngưng kết chỉ có thể quan sát bằng mắt thường khi có 100 đám tủa được tạo thành, mỗi đám tủa có kích thước 50 mm và được tạo thành từ 105
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thể. Do đó, số phân tử kháng nguyên cần có để phát hiện được bằng phản ứng ngưng kết là khoảng 100x105
x10=108 phân tử [72].
Để có thể tìm được nồng độ kháng thể thích hợp nhất, chúng tôi tiến hành phản ứng gắn kháng thể đơn chuỗi lên bề mặt hạt latex với nồng độ lần lượt 100 g, 200 g và 400 g. Hạt latex sau khi đã gắn kháng thể lên bề mặt được trộn với kháng nguyên H5 của virus H5N1 đã được làm bất hoạt. Phản ứng ngưng kết xảy ra, tuy nhiên mức độ ngưng kết là khác nhau tương ứng với nồng độ kháng thể đơn chuỗi.
Hình 3.10. Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên H5 với hạt latex được gắn với 100, 200 và 400 g kháng thể đơn chuỗi VH10.
Hình ảnh được chụp trên kính hiển vi với độ phóng đại 10×10. A: Phản ứng âm tính; B, C, D: phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên H5 của H5N1 với hạt latex được gắn 100, 200, 400 g kháng thể đơn chuỗi VH10.
Với hạt latex được gắn kháng thể đơn chuỗi ở nồng độ 100 g, rất khó quan sát thấy sự ngưng kết kháng nguyên kháng thể bằng mắt thường, chỉ dưới kính hiển vi 10×10 mới thấy hiện tượng ngưng kết xảy ra rải rác (Hình 3.11B). Hiện tượng ngưng kết được quan sát rất rõ ràng bằng mắt thường khi trộn hạt latex đã gắn 200 g, 400 g VH10 với kháng nguyên H5 (Hình 3.11C, 3.11D) nhưng khi gắn 400 g VH10 lên bề mặt hạt latex thì phản ứng ngưng kết xảy ra rõ ràng, nhiều nhất. Trong khi đó, hiện tượng ngưng kết không xuất hiện khi trộn hạt latex được gắn VH10 với dung dịch PBS (Hình 3.11A). Các kết quả này cũng phù hợp với những kết quả tối ưu lượng kháng nguyên HBcAg gắn lên bề mặt hạt latex của tác giả Chu Hoàng Hà và cộng sự (2007) [6].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Như vậy, muốn có phản ứng ngưng kết quan sát được bằng mắt thường thì hạt latex phải được gắn với số kháng thể đủ lớn. Khi hạt latex được gắn với 400 g kháng thể VH10, chúng tôi thấy rằng phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh và rất rõ ràng. Do đó, đây là lượng thích hợp để gắn lên bề mặt hạt latex và sử dụng chúng trong chẩn đoán virus cúm A/H5N1.
3.2.2. Xây dựng phƣơng pháp chẩn đoán virus cúm A/H5N1 bằng phán ứng ngƣng kết hạt latex
Thực hiện phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể bằng cách: nhỏ 10 µl hạt latex gắn cấu trúc kháng thể đơn chuỗi VH10 lên lam kính sạch, sau đó nhỏ 10 µl mẫu dung dịch chứa virus H5N1 khuấy đều bằng đầu tip. Để ở nhiệt độ phòng 2- 3 phút, quan sát sự ngưng kết.
Hình 3.11. Mô hình kiểm tra tính ngưng kết của hạt latex đã gắn protein lên bề mặt
Nếu mẫu thử dương tính với virus cúm A/H5N1, kháng thể VH10 tái tổ hợp sẽ phản ứng với kháng nguyên H5 của virus H5N1 trong mẫu thử. Phức hợp kháng nguyên kháng thể sẽ được tạo ra với giá đỡ là các hạt latex, từ đó sẽ hình thành nên các cụm tủa giữa kháng thể và kháng nguyên bao quanh hạt latex làm trung tâm. Sự ngưng kết có thể dễ dàng quan sát bằng mắt thường và được chụp ảnh dưới kính hiển vi. Ngược lại, nếu mẫu thử âm tính với virus cúm A/H5N1 thì sẽ không xuất hiện sự lắng tủa của phức hợp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Để đánh giá khả năng phát hiện sự có mặt của kháng nguyên có trong mẫu bệnh, chúng tôi thử các khả năng ngưng kết của hạt latex có gắn 400 g kháng thể VH10 với những nồng độ kháng nguyên khác nhau. Cụ thể chúng tôi pha loãng kháng nguyên ở các mức nồng độ khác nhau như 10 lần, 100 lần, 1000 lần để xác định mức độ ngưng kết của hạt latex.
Lần 1: khi không pha loãng kháng nguyên hiệu giá 256 chúng tôi thấy mức độ ngưng kết rõ ràng, có thể thấy được bằng mắt thường, còn khi quan sát bằng kính hiển vi có độ phóng đại là 10×10 thì nhận thấy vùng ngưng kết là rất lớn và có mật độ dầy đặc.
Lần 2: kháng nguyên được pha loãng 10 lần, sau đó thực hiện phản ứng ngưng kết và quan sát sau khoàng 2 đến 3 phút, chúng tôi nhận thấy các kết tủa khó quan sát bằng mắt thường, dung dịch trong và đồng nhất. Khi soi dưới kính hiển vi thì thấy mật độ các vùng ngưng kết có thưa hơn và diện tích cũng nhỏ đi.
Lần 3: kháng nguyên được pha loãng 100 lần và thực hiện phản ứng ngưng kết. Sau 2 đến 3 phút, không thể quan sát được các kết tủa bằng mắt thường, dung dịch sau khi trộn lẫn đồng nhất, không phát hiện tủa lắng đọng. Do đó, chúng tôi tiến hành quan sát sự ngưng kết dưới kính hiển vi và nhận thấy mật độ và diện tích các vùng ngưng kết rất thưa.
Lần 4: pha loãng kháng nguyên 1000 lần và tiến hành phản ứng ngưng kết. Lúc này, không thể quan sát được hiện tượng ngưng kết bằng mắt thường nên sau khi soi dưới kính hiển vi, ảnh cho thấy mật độ lúc này là rất thưa và diện tích rất nhỏ nên chúng tôi quyết định không pha loãng nữa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.12. Kết quả phản ứng ngưng kết soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10×10. A: Phản ứng âm tính; B: Kháng nguyên không pha loãng (hiệu giá HA là 256); C: Kháng nguyên được pha loãng 10 lần; D: Kháng nguyên được pha loãng 100 lần; E: Kháng nguyên được pha loãng 1000 lần.
Từ kết quả trên có thể kết luận, chúng tôi đã bước đầu thành công trong việc ứng dụng phương pháp gắn kết hạt latex có gắn kháng thể đơn chuỗi trong phát hiện nhanh virus H5N1 ở nồng độ kháng nguyên thấp.
Sau khi chuẩn hóa lượng kháng thể VH10 gắn lên bề mặt hạt latex, đồng thời đánh giá khả năng phát hiện sự có mặt của kháng nguyên với các nồng độ khác nhau, chúng tôi tiến hành xây dựng bộ kit phát hiện sự có mặt của virus H5N1 bằng phản ứng ngưng kết latex. Bộ kit được xây dựng gồm có:
1. Ống đựng dung dịch latex loại 2 ml: 02 ống (mỗi ống 300µl dung dịch latex có gắn kháng thể VH10)
2. Pipet hút: 12 chiếc
3. Dung dịch pha mẫu: 03 ống (mỗi ống chứa 1ml dung dịch pha mẫu)
4. Lam kính + lamen: 12 bộ 5. Bông lau lam kính
6. Giấy hướng dẫn sử dụng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.3. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và thử nghiệm bộ kit latex 3.3.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit latex 3.3.1. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit latex
Để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit latex, phản ứng ngưng kết được thực hiện với dàn mẫu thử là các mẫu nước trứng (Allantoic fluid), đây là dịch niệu mô của trứng gà có phôi được gây nhiễm bằng virus lấy từ thực địa. Kết quả thử nghiệm thu được ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm bộ kit latex với các mẫu nước trứng
STT Ký hiệu Loại mẫu Kit latex Phƣơng pháp
ngƣng kết hồng cầu
1 A1945 Allantoic fluid +++ +
2 A1457 Allantoic fluid +++ +
3 A1433 Allantoic fluid +++ +
4 A1249 Allantoic fluid +++ +
5 A1440 Allantoic fluid + +
6 A1932 Allantoic fluid + +
7 A1416 Allantoic fluid ++ +
8 A1928 Allantoic fluid + +
9 A1974 Allantoic fluid + +
10 A1938 Allantoic fluid + +
11 A1833 Allantoic fluid ++ -
12 A1832 Allantoic fluid + +
13 A1747 Allantoic fluid ++ +
14 A1813 Allantoic fluid + +
15 A1814 Allantoic fluid + +
16 GS4-159 Allantoic fluid - -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
18 GS4-10 Allantoic fluid - -
19 GS4-170 Allantoic fluid - -
20 GS4-346 Allantoic fluid - -
Ghi chú: Các mẫu có số thứ tự từ 16 đến 20 là các mẫu nước trứng không lây nhiễm virus H5N1, các mẫu từ 1 đến 15 là các mẫu nước trứng lây nhiễm virus H5N1 lấy từ thực địa. Ký hiệu (-) mẫu âm tính, (+) mẫu dương tính, (++) mức độ ngưng kết cao có thể quan sát dễ dàng bằng kính hiển vi có độ phóng đại 10×10, (+++) mức độ ngưng kết mạnh có thể quan sát tủa dễ dàng bằng mắt thường.
Kết quả thực hiện phản ứng ngưng kết với 20 mẫu thử dạng nước trứng ở bảng 3.1 cho thấy, bộ kit ngưng kết latex hoạt động rất ổn định với các mẫu dương tính và không có hiện tương dương tính giả. Các mẫu dương tính có số thứ tự từ 1 đến 15 đều cho kết quả ngưng kết với các mức độ khác nhau. Đáng chú ý các mẫu có số thứ tự từ 1 đến 4 cho kết quả ngưng kết mạnh và dễ dàng quan sát được bằng mắt thường hiện tượng kết tủa chỉ sau 3 phút ngưng kết. Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit latex được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit latex
Sinh phẩm Mẫu nước trứng Cộng
Dương tính Âm tính
Kit latex Dương tính 15 0 15
Âm tính 0 5 5
Cộng 15 5 20
Các kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, bộ kit latex có độ nhạy là 15/15 (100%), độ đặc hiệu là 5/5 (100%).
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp ngưng kết hồng cầu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sinh phẩm Mẫu nước trứng Cộng
Dương tính Âm tính Ngưng kết hồng cầu Dương tính 14 1 15 Âm tính 1 4 5 Cộng 15 5 20
Trong 15 mẫu nước trứng có lây nhiễm virus H5N1, phương pháp ngưng kết hồng cầu chỉ khả năng phát hiện được 14/15 dương tính. Do đó, độ nhạy của phương pháp này là 14/15 (93,33%) và độ đặc hiệu là 4/5 (80%). Từ các kết quả trên có thể thấy, bộ kit ngưng kết latex có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với phương pháp ngưng kết hồng cầu.
Bộ kit latex chẩn đoán virus cúm A/H5N1 do chúng tôi tạo ra có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với bộ kit latex chẩn đoán virus cúm A/H5N1 do Xu và cộng sự tạo ra năm 2005, với độ nhạy là 88,8% và độ đặc hiệu là 97,6% [66]. Độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit latex chẩn đoán virus cúm A/H5N1 của Xu và cộng sự được đánh giá trên một lượng mẫu thử lớn (830 mẫu) và kết quả cũng cho thấy phương pháp ngưng kết hạt latex có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với phương pháp ngưng kết hồng cầu [66].
Để đánh giá tính đặc hiệu với kháng nguyên H5 của virus H5N1, bộ kit latex được kiểm tra với ba mẫu virus khác nhau gồm: virus H9N2, virus Newcastle và virus H5N1. Trong đó, virus Newcastle là virus gây bệnh gây dịch tả ở gà do nhóm Paramyxovirus gây nên, có triệu chứng biểu hiện bệnh giống với cúm A/H5N1. Virus H9N2 thuộc nhóm Influenza A virus gây bệnh cúm ở chim. Mẫu A1538 có chứa virus H5N1 được dùng làm đối chứng. Kết quả thu được tại bảng 3.5.
Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu với kháng nguyên H5 của bộ kit latex
STT Ký hiệu Virus Kit latex
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2 1102 Newcastle Âm tính
3 A1538 H5N1 Dương tính
Từ bảng 3.4 cho thấy, trong ba loại virus được dùng cho phản ứng ngưng kết latex thì bộ kit latex cho kết quả âm tính với hai mẫu virus Newcastle và H9N2, mẫu virus H5N1 cho kết quả dương tính. Do đó có thể thấy kit ngưng kết latex chỉ đặc hiệu với kháng nguyên H5 virus cúm A/H5N1.
3.3.2. Đánh sự hoạt động của bộ kit latex với các mẫu thực địa
Để đánh giá khả năng hoạt động của bộ kit latex, chúng tôi sử dụng các mẫu chứa virus H5N1 thu ngoài thực địa. Đây là những mẫu chứa virus có chứa các chất tạp nhiễm từ môi trường xung quanh nên lượng virus thường thấp, đã được đánh giá trước sự có mặt của virus bằng phản ứng Real time PCR tại Trung tâm chẩn đoán thú y Trung ương. Các mẫu sử dụng gồm 2 loại:
Loại mẫu thứ nhất là dịch nghiền mô và não (Homo) của gia cầm nghi nhiễm cúm, gồm 8 mẫu (A1538, A1544, A1546, A1547, A1548, A1549, A1567, A1586) trong đó mẫu A1567 cho phản ứng âm tính với phản ứng Real time PCR.
Loại mẫu thứ hai là mẫu dịch ngoáy hầu họng của gia cầm nghi nhiễm cúm (Swab), gồm 12 mẫu (A1562, A1563, A1564, A1565, A1566, N156, N157, N158, N160, V187, V544, V550), trong đó có 4 mẫu (A1562, A1563, A1564, A1565) cho kết quả âm tính với phản ứng Real time PCR. Kết quả thử nghiệm thu được ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm bộ kit latex phát hiện virus cúm A/H5N1 với các mẫu thực địa
ST
T Ký hiệu Loại mẫu
Phƣơng pháp
Real time PCR Kit latex
Phƣơng pháp ngƣng kết
hồng cầu
1 A1538 Homo + ++ -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 A1546 Homo + + - 4 A1547 Homo + + - 5 A1548 Homo + ++ - 6 A1549 Homo + + - 7 A1586 Homo + ++ + 8 A1567 Homo - - - 9 A1562 Swab - - - 10 A1563 Swab - - - 11 A1564 Swab - - - 12 A1565 Swab - - - 13 A1566 Swab + + + 14 N156 Swab + + + 15 N157 Swab + ++ + 16 N158 Swab + ++ + 17 N160 Swab + ++ - 18 V187 Swab + + + 19 V544 Swab + + + 20 V550 Swab + + -
Ghi chú: Các mẫu có số thứ tự từ 8 đến 12 là các mẫu âm tính khi kiểm tra bằng phản ứng Real Time PCR. Ký hiệu (-) mẫu âm tính, (+) mẫu dương tính, (++) mức độ ngưng kết cao có thể quan sát dễ dàng bằng kính hiển vi có độ phóng đại 10×10, Homo: Mẫu dịch nghiền tổ chức là dịch nghiền não và phổi gia cầm nghi mắc cúm, Swab: Mẫu dịch ngoáy là dịch ngoáy họng gia cầm nghi mắc cúm, bảo quản trong dung dịch PBS.
Phản ứng ngưng kết được thực hiện với 20 mẫu thực địa, kết quả ở bảng 3.5 cho thấy bộ kit latex không phát hiện được cụm tủa tại các mẫu âm tính với phản ứng Real time PCR. Ở các mẫu cho kết quả dương tính với phản ứng Real time PCR thì khi thử với phản ứng ngưng kết latex đều xuất hiện các cụm tủa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Đặc biệt các mẫu A1538, A1544 A1548, A1586, N157, N158, N160 cho thấy các cụm tủa rất rõ ràng khi soi lên kinh hiển vi có độ phóng đại 10×10.
Kết quả ở bảng 3.5 cũng cho thấy, khả năng phát hiện virus với các mẫu thực địa của phương pháp ngưng kết ngưng kết hồng cầu kém hơn nhiều so với phương pháp ngưng kết latex. Trong 15 mẫu dương tính với phản ứng Real time PCR, phương pháp ngưng kết hồng cầu chỉ cho kết quả dương tính với 7 mẫu. Điều này có thể giải thích là do các mẫu thực địa có độ tinh sạch không cao và lẫn nhiều tạp chất gây ảnh hưởng tới phản ứng ngưng kết hồng cầu.
Như vậy, bộ kit latex cho kết quả chẩn đoán virus cúm A/H5N1 tương tự với phương pháp Real time PCR, do đó có thể dùng bộ kit latex để phát hiện