Các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin (6 chủng) được tiến hành kiểm tra một số đặc điểm sinh học và phân loại, kết quả thể hiện ở Bảng 3.7.
Bảng 3.8. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
STT Tên chủng Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào
1 Cr2 Hình tròn, có nhân, màu trắng
sữa, đường kính 0.4 cm Vi khuẩn Gram (-), hình que 2 Cr9 Hình tròn, có nhân, màu nâu
đục, đường kính 1cm Vi khuẩn Gram (+), hình que 3 Cr10 Hình tròn , có nhân, màu nâu
STT Tên chủng Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào
4 Cr11
Hình tròn, có nhân màu trắng đục, xung quanh màu nhạt
hơn, đường kính 0.8 cm
Vi khuẩn Gram (+), hình que
5 Cr15 Cạnh không đều, có nhân, màu
nâu đậm, đường kính 1 cm Vi khuẩn Gram(-), hình que
6 Cr16
Hình tròn, có nhân màu vàng đục, xung quanh màu trắng
sữa, đường kính 0.5 cm
Vi khuẩn Gram(-), hình que
(Chú thích: Tất cả các được nuôi cấy trên môi trường TSA sau 24 giờ, ở 370C)
Với 6 chủng sau khi kiểm tra bản chất protein của bacteriocin chúng tôi tiến hành cấy điểm và nhuộm Gram để xác định một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và phân loại của các chủng trên. Kết quả nhuộm Gram cho thấy trong 6 chủng thì có 3 chủng chủng Gram âm (Cr2, Cr15, Cr16) và 3 chủng Gram dương (Cr9, Cr10, Cr11).
Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Cr15 dưới độ phóng đại X-100 3.3.2. Khả năng chịu muốị
Với kết quả vòng kháng tốt nhất, chủng Cr15 được đem đi định danh và xác định khả năng chịu muốị Kết quả về khả năng chịu muối (NaCl) của chủng Cr15 được trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả về khả năng chịu muối của chủng Cr15
Nồng độ muối NaCl (%) 1 2 3 4 5 6 7 8
Khả năng chịu muối +++ +++ +++ ++ ++ + - -
Kết quả từ Bảng 3.9 cho thấy, với nồng độ muối từ 1-3 % thì chủng Cr15 sinh trưởng rất tốt, và đến 4 %, 5 %, 6 % thì sinh trưởng có dấu hiệu giảm dần cho đến nồng độ muối NaCl từ 7 % trở đi thì chủng Cr15 không thể phát triển được.
Hình 3.7. Khả năng chịu muối của chủng Cr15 3.3.3. Định danh các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin
Sau khi kiểm tra bản chất protein của dịch bacteriocin, các chủng sinh bacteriocin được đem đi định danh nhờ kỹ thuật PCR. Chủng được chọn để định danh là chủng Cr15 .
• Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn phân lập Cr15
51 GCTAATACCG CATAATGTCT ACGGACCAAA GCAGGGGCTC TTCGGACCTT 100 101 GCACTATCGG ATGAACCCAT ATGGGATTAG CTAGTAGGTG GGGTAAAGGC 150 151 TCACCTAGGC GACGATCTCT AGCTGGTCTG AGAGGATGAT CAGCCACACT 200 201 GGGACTGAGA CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT 250 251 TGCACAATGG GCGCAAGCCT GATGCAGCCA TGCCGCGTGT ATGAAGAAGG 300 301 CCTTAGGGTT GTAAAGTACT TTCAGCGGGG AGGAAGGTGA TAAGGTTAAT 350 351 ACCCTTATCA ATTGACGTTA CCCGCAGAAG AAGCACCGGC TAACTCCGTG 400 401 CCAGCAGCCG CGGTAATACG GAGGGTGCAA GCGTTAATCG GAATTACTGG 450 451 GCGTAAAGCG CACGCAGGCG GTCAATTAAG TCAGATGTGA AAGCCCCGAG 500 501 CTTAACTTGG GAATTGCATC TGAAACTGGT TGGCTAGAGT CTTGTAGAGG 550 551 GGGGTAGAAT TCCATGTGTA GCGGTGAAAT GCGTAGAGAT GTGGAGGAAT 600 601 ACCGGTGGCG AAGGCGGCCC CCTGGACAAA GACTGACGCT CAGGTGCGAA 650 651 AGCGTGGGGA GCAAACAGGA TTAGATACCC TGGTAGTCCA CGCTGTAAAC 700 701 GATGTCGATT TAGAGGTTGT GGTCTTGAAC CGTGGCTTCT GGAGCTAACG 750 751 CGTTAAATCG ACCGCCTGGG GAGTACGGCC GCAAGGTTAA AACTCAAATG 800 801 AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGATGC 850 851 AACGCGAAGA ACCTTACCTA CTCTTGACAT CCAGCGAATC CTTTAGAGAT 900 901 AGAGGAGTGC CTTCGGGAAC GCTGAGACAG GTGCTGCATG GCTGTCGTCA 950 951 GCTCGTGTTG TGAAATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTA 1000 1001 TCCTTTGTTG CCAGCACGTA ATGGTGGGAA CTCAAAGGAG ACTGCCGGTG 1050 1051 ATAAACCGGA GGAAGGTGGG GATGACGTCA AGTCATCATG GCCCTTACGA 1100 1101 GTAGGGCTAC ACACGTGCTA CAATGGCAGA TACAAAGAGA AGCGACCTCG 1150 1151 CGAGAGCAAG CGGAACTCAT AAAGTCTGTC GTAGTCCGGA TTGGAGTCTG 1200 1201 CAACTCGACT CCATGAAGTC GGAATCGCTA GTAATCGTAG ATCAGAATGC 1250 1251 TACGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA CACCGCCCGT 1290
Các trình tự được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit 7.1.3.0 và Genious Pro 5.5.7, và được so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank bằng chương trình BLAST (www.ncbịnlm.nih.gov/blast/). Kết quả so sánh điểm tương đồng được trình bày ở Bảng 3.10.
Bảng 3.10. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng Cr15 với các trình tự tương đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
Số hiệu gen Mô tả Tỷ lệ che
phủ Mức ý nghĩa Độ tương đồng NR_043997.1
Proteus mirabilis strain NCTC 11938 16S ribosomal RNA, partial sequence
100% 0.0 99%
NR_043998.1
Proteus penneri strain NCTC 12737 16S ribosomal RNA, partial sequence
97% 0.0 99%
NR_025336.1
Proteus vulgaris strain DSM 30118 16S ribosomal RNA, partial sequence
100% 0.0 99%
NR_043999.1
Proteus myxofaciens strain NCIMB 13273 16S ribosomal RNA, partial sequence
100% 0.0 98%
NR_043648.1
Xenorhabdus hominickii strain KE01 16S ribosomal RNA, partial sequence
99% 0.0 96%
NR_042327.1
Xenorhabdus ehlersii strain :DSM 16337 16S ribosomal RNA, partial sequence
100% 0.0 95%
Kết luận : Kết quả từ bảng 3.10 cho thấy trình tự nucleotide của đoạn gen 16S rDNA của chủng Cr15 có độ tương đồng cao nhất (99%) với 3 loài đó là : Proteus mirabilis; Proteus penneri; Proteus vulgaris. Vì vậy, chủng Cr15 phân lập từ ruột cá chim vây vàng thuộc chi Proteus.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Từ các mẫu ruột cá chim vây vàng được lấy từ Trại cá Trường Đại học Nha Trang (tại Vũng Ngán - Nha Trang - Khánh Hòa) chúng tôi đã phân lập được 43 chủng vi khuẩn. Trong đó có 6 chủng có khả năng sinh bacteriocin bao gồm Cr2, Cr9, Cr10, Cr11, Cr15 và Cr16 chiếm tỷ lệ 14%. Cả 6 chủng này đều mất hoạt tính kháng khuẩn khi xử lý bằng enzym proteinase K. Tiếp tục xử lý bằng enzym trypsin thì 3 trong số 6 chủng trên mất hoạt tính kháng khuẩn (Cr9, Cr11 , Cr16 ).
2. Tiến hành nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào thì trong 6 chủng sinh bacteriocin này có 3 chủng Gram dương (Cr9, Cr10, Cr11,) và 3 chủng Gram âm (Cr2, Cr15, Cr16), tất cả các chủng đều hình quẹ
3. Chủng Cr15 là chủng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất nên được lựa chọn để định danh. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng Cr15: Có nhân, cạnh không đều, giữa màu vàng nhạt và nhạt dần từ trong ra ngoài, đường kính 1 cm sau 24 giờ nuôi cấỵ Chủng này có khả năng chịu muối muối NaCl đến 6%.
4. Kết quả định danh bằng kỹ thuật PCR cho thấy chủng Cr15 thuộc chi
Proteus. Kiến nghị
1. Tiếp tục định danh các chủng sinh bacteriocin còn lại (Cr2, Cr9, Cr11, Cr16). 2. Nghiên cứu thêm một số tính chất của dịch bacteriocin thô như: khả năng bền nhiệt, bền pH, khảo sát phổ hoạt tính, xác định cơ chế hoạt động của bacteriocin...của các chủng đã phân lập (Cr2, Cr9, Cr11, Cr15, Cr16).
3. Tiếp tục nghiên cứu để áp dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản như: Tinh chế dịch bacteriocin tinh khiết từ các chủng này dùng làm thuốc kháng sinh sinh học, thử nghiệm bổ sung các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin vào các chế phẩm sinh học nhằm cải tạo môi trường nuôị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt :
1. Đỗ Bích Trâm, Võ Thị Trúc Linh, Huỳnh Thị Thu Vân, Nguyễn Thị Thanh Thủy, 10/2010. Bacteriocin và ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh, tr.3 – 15.
2. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004.
Bệnh học thủy sản, NXB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, Tp. Hồ Chí Minh, tr.224 -231.
3. Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ,
số 1/2008. Các loại bệnh thường gặp trên cá biển nuôi khánh hòa, Tạp chí khoa học và công nghệ thủy sản-Đại học Nha Trang, tr.16 – 24.
4. Lại Mai Hương, Lê Văn Việt Mẫn. Giáo trình thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa-Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, tr.7 - 47. 5. Lê Thanh Huân, 2011. Phân lập tuyển chọn và đánh giá đặc tính probiotic một
số chủng Lactobacillus trên Cá Chim vây vàng, Luận văn tốt nghiệp Đại học, Đại học Nha Trang, tr. 3 - 18.
6. Lương Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr.358.
7. Nguyễn Đình Mão, Vũ Trung Tạng, 2006. Khai thác và sử dụng bền vững đa dạng sinh học thủy sinh vật và Nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tr. 45-48.
8. Nguyễn Lân Dũng và các tác giả, 1972. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 1, NXB KH & KT, Hà Nộị
9. Nguyễn Lân Dũng và các tác giả, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 2, NXB KH & KT, Hà Nộị
10. Nguyễn Lân Dũng và các tác giả, 1978. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập 3. NXB KH & KT, Hà Nộị
11. Nguyễn Thị Thanh Tâm, 2011. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm, Đồ án tốt nghiệp Đại học, Đại học Nha Trang, tr.23 - 37.
12. Trần Văn Vỹ, 2004. Giáo trình thủy sản, NXB Đại học Sư phạm.
Tiếng Anh :
13. Balca´zar J L, Loureiro1 L, Silva Y J D, Pintado1 J and Planas M, 2010.
Identification and characterization of bacteria with antibacterial activities isolated from seahorses(Hippocampus guttulatus), The Journal of Antibiotics 63, p. 271- 274.
14. Dutton C J. Peptide antibiotics: discovery, modes of action, and applications.
15. Gálvez A, Abriouel H, López R L, Omar N B, 2007. Bacteriocin-based strategies for food biopreservation, International Journal Food Microbiology, p. 51 - 70.
16. Fay J M. Modern food microbiology-sixth edition.
17. Hoang Hoa Hong, Book of abstracts Vietnam – Taiwan international conference on seed breeding technology and mariculture – ĐH Nha Trang, p.4 – 6.
18. Nguyen Van Duy, 2011. Marine bacteriocin as a new drug for aquaculture health. Tạp chí KHCNTS, p.49 - 55
19.Riley M A, Osnat Gillor, research and applications in bacteriocins
20. Vuyst L D, Leroy F, 2007. Bacteriocin from Lactic Acid Bacteria: Production, Purrification, and Food Application, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnogy, p.194 - 199.
PHỤ LỤC
• Phụ Lục 1. Quy trình tách chiết DNA bằng theo bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification System (Promega) :
- Các chủng vi khuẩn được tăng sinh trên môi trường LB 3% và ủ ở 42oC trong 24 giờ. - Lắc đều, hút 1,5 ml dịch tăng sinh cho vào ống Eppendort 1,5 ml vô trùng. - Ly tâm 13000 vòng trong 2 phút, loại bỏ phần dịch nổi bên trên, rửa cặn tế bào
2 lần bằng đệm TE 1X rồi ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần dịch nổị - Sau đó thêm vào 275 µl dung dịch phá tế bào vào mỗi ống, vortex đềụ
Thành phần Thể tích (µl) Đệm TE 10:1 200 EDTA 0,5 M (pH 8,0) 50 Protease K 20 mg/ml 20 Rnase A 4 mg/ml 5 Tổng 275
- Ủ ống mẫu trên block nhiệt ở 55oC trong 2 giờ.
- Thêm 250 µl dung dịch đệm (Wizard SV Lysis Buffer) vào mỗi ống, sau đó đem vortex nhẹ.
- Spin nhẹ, thu phần dịch nổi ở mỗi ống sang các cột Wizard SV Minicolumn (được đặt trên các ống thu mẫu 1,5 ml).
- Ly tâm 13000 vòng trong 2 phút, loại bỏ dịch thu được.
- Chuyển các cột Wizard SV Minicolumn sang các ống thu mẫu 1,5 ml mớị - Thêm vào 650 µl dung dịch rửa (Wizard SV Wash Solution).
- Ly tâm 13000 vòng 2 phút, loại bỏ phần dung dịch rửa thu được. - Lặp lại bước rửa này thêm 1 lần nữạ
- Chuyển cột Wizard SV minicolumn sang một Eppendorf 1,5 ml mớị - Thêm vào 100 µl dung dịch đệm TE 1X, ly tâm ở 13000 vòng trong 2 phút. - Cột Wizard SV Minicolumn được loại bỏ, dịch chiết DNA được thu nhận.
- Dịch chiết DNA được bảo quản ở - 20 C cho đến khi sử dụng.
• Phụ lục 2. Một số hình ảnh về khả năng kháng khuẩn của dịch ngoại bào các chủng VK phân lập.
• Phụ lục 3. Một số hình ảnh về vòng kháng khuẩn sau khi xử lý bằng enzym proteinase K.
• Phụ lục 4. Một số hình ảnh về vòng kháng khuẩn sau khi xử lý bằng enzym trypsin.
• Phụ lục 5. Hình thái khuẩn lạc và tế bào các chủng sinh Bacteriocin
Cr2
Cr16
Cr10