• Xác định hình thái khuẩn lạc bằng phương pháp cấy điểm
Nhằm mục đích miêu tả đầy đủ hơn hình dáng, kích thước cũng như màu sắc các khuẩn lạc được rõ hơn ta tiến hành cấy điểm. Chuẩn bị môi trường TSA trên các đĩa petri, hơ nóng que cấy điểm trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội dùng đĩa chứa những chủng đã ria trước đó, chọn một khuẩn lạc rời riêng rẽ. Sau đó cẩn thận lấy một ít khuẩn lạc lên đầu que cấy đưa sang môi trường TSA đã đỗ trên các đĩa Petri, dùng que cấy chấm một điểm nhẹ vào trung tâm đĩa sau đó đậy nắp đĩa lại và gói giấy báo để trong tủ ấm 370C sau 24-36 giờ ta tiến hành mô tả hình thái khuẩn lạc.
• Nhuộm Gram
Phương pháp nhuộm này sử dụng hai màu khác nhau, dùng để phân biệt tế bào VK Gram âm (G-) và VK Gram dương (G+). Vi khuẩn G+ có thành tế bào dày, bao gồm nhiều lớp peptidoglycan. Vi khuẩn G- có lớp peptidoglycan mỏng và lớp lipopoly-saccharidẹ
Trong phương pháp nhuộm Gram, tím tinh thể Violet được sử dụng như màu thứ nhất. Tím tinh thể cũng là màu bazo, làm cho tất cả các tế bào VK trên tiêu bản bắt màụ Liugol là chất cẩn màu, có khả năng tạo phức chất với tím tinh thể. Phức chất này không tan trong tế bào VK, do đó làm cho tế bào bắt màu rõ hơn. Cồn ethanol được dùng trong bước tiếp theo để tẩy màu khỏi tế bào Gram âm, trong khi tế bào Gram dương vẫn giữ màụ Sau đó tế bào Gram âm sẽ được nhuộm lại bằng màu thứ hai thường là Fuschin. Khi quan sát dưới kính hiển vi, tế bào Gram dương có màu tím của tím tinh thể, còn tế bào Gram âm có màu hồng của Fuschin.
- Cách tiến hành:
+ Dùng bút viết kính vẽ 1 đường tròn lên lam kính để giới hạn vùng phết vi khuẩn. + Nhỏ 1 giọt nước từ bình tia vào vòng tròn đã vẽ.
+ Dùng que cấy thu sinh khối từ khuẩn lạc chọn lọc, rồi đưa vào lam kính, dàn đều vi khuẩn, để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn, tránh để lâu quá nóng sẽ làm tế bào vi khuẩn vỡ ra, làm lệch kết quả quan sát.
+ Nhỏ vài giọt tím tinh thể violet lên tiêu bản, để trong 30 giây đến 1 phút. + Nghiêng đổ rồi rửa lại nước.
+ Nhuộm màu tiêu bản bằng thuốc nhuộm Lugol trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa nhẹ với nước bằng bình tiạ
+ Rửa tiêu bản vừa nhuộm với cồn 90o cho đến khi phiến kính bạc màu trong khoảng 10-15 giây, rồi rửa lại với nước.
+ Nhuộm tiếp tiêu bản với Fuchsin trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa lại với nước.
+ Để khô tự nhiên hoặc dung giấy thấm lau tiêu bản cho sạch xung quanh vùng vi khuẩn, sau đó đưa lên vật kính dầu quan sát X -100.
Hình 2.5. Hình ảnh minh họa các bước nhuộm Gram