• Tiến hành thử tính đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đối với 2 vi khuẩn đích Bacillus B1.1 và Vibrio V1.1
- Mục đích: Thử tính đối kháng của VK phân lập từ ruột cá chim vây vàng đối với các VK đích, đây là những chủng VK gây bệnh thường gặp trên tôm, cá nuôị
- Nguyên lý: Sau khi nuôi dịch lỏng vi khuẩn phân lập trong 16-20 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch bacteriocin thô và chỉnh pH về 7 để loại bỏ tác dụng của một số axit hữa cơ do vi khuẩn tiết ra có trong dịch, sau đó tiến hành thử hoạt tính với các chủng chỉ thị. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch. Ở phương pháp này, chủng VK thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được nuôi trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khuyếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo giếng trên thạch bằng cách đục các giếng, tra dịch của chủng thử nghiệm đã được ly tâm trước đó vào và ủ ở nhiệt độ thích hợp. Phương pháp này thích hợp đối với kiểm tra những khuẩn lạc riêng rẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền.
- Cách tiến hành : Các bước tiến hành được trình bày ở Hình 2.4
Hình 2.4. Quy trình thử tính đối kháng của dịch VK phân lập đối với các chủng chỉ thị (Bacillus B1.1 và Vibrio V1.1)
• Giải thích quy trình :
Dịch VK sau khi ta đã nuôi cấy qua đêm, sau đó hút 1.5 ml dịch VK vào ống eppendorf để ly tâm 6000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, ở 40C để loại bỏ sinh khối tế bào và thu dịch nổi, hút 1ml dịch nổi và đo pH ban đầụ Lưu ý là thao tác hút cẩn thận không sinh khối tế bào ở đáy có thể hòa trở lại vào dịch gây nên hiện tượng phát triển của chủng vi khuẩn này xung quanh vòng các giếng đục lỗ. Sau đó mới tiến hành điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 2N hoặc HCl 1N để đưa về pH
Dịch vi khuẩn nuôi cấy ở 370C trong 14-16 giờ
Hút 1.5 ml dịch vi khuẩn vào ống eppendorf đã hấp khử trùng
Ly tâm dịch ở 6000 vòng/phút, trong 30 phút, ở 40C
Dịch bacteriocin thô
Hút 1 ml dịch bacteriocin thô đã loại bỏ cặn và tiến hành điều chỉnh pH của dịch bacteriocin thô, đưa về pH = 7
Thử hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Sau 14-16 giờ thu nhận và đo kích thước vòng kháng khuẩn
= 7. Bước này nhằm mục đích loại bỏ sự ảnh hưởng của một số acid hữu cơ tiết ra có thể làm ta nhầm lẫn trong việc xác định bacteriocin của vi khuẩn phân lập tiết rạ
Sau đó tiến hành thử hoạt tính bằng phương pháp khếch tán trên thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa VSV kiểm định và VSV chỉ thị. Đun nóng môi trường TSA, lắc đềụ Tiếp đó, đổ 20-25 ml môi trường vào đĩa petri, ta để thạch đông hoàn toàn thì tiến hành cấy trang các chủng VK chỉ thị lên trên bề mặt thạch bằng cách hút 100 µl dịch VK chỉ thị đã tiến hành nuôi lắc trước đó cho vào đĩa thạch môi trường và trang đều lên bề mặt. Sau đó hút 100 µl dịch bacteriocin thô vào các giếng thạch. Ủ đĩa ở 370C trong 14-16 giờ thì kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng. Hoạt tính được biểu thị bằng kích thước vòng kháng và được tính như sau : H =D d−
Trong đó :
- H : hiệu số vạch phân giải (mm)
- D : đường kính vòng phân giải+ đường kính lỗ đục (mm) - d : đường kính lỗ đục (mm)
• Xác định bản chất protein của dịch bateriocin bằng enzym proteinase K và trypsin
- Mục đích: Kiểm tra dịch ngoại bào các chủng vi khuẩn phân lập có bản chất là protein của một bacteriocin không.
- Nguyên lý: bacteriocin có bản chất protein nên dưới tác dụng của enzym proteinase K, enzym trypsin thì sẽ bị thủy phân, mất tính kháng đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị.
- Bố trí thí nghiệm:
Sử dụng dịch VK đã ly tâm và điều chỉnh pH bằng NaOH 2N hoặc bằng HCl 3N (các thao tác chuẩn bị dịch đã nêu rõ trước đó).
Enzym proteinase K và trypsin được pha sẵn trước đó với nồng độ 20 mg/ml được bảo quản lạnh, khi cần dùng thì mới lấy ra hút nhanh cho vào dịch bacteriocin thô. Tỷ lệ enzym / dịch ngoại bào của VK phải đạt nồng độ cuối cùng là 1 mg/1 ml dịch VK. Để đạt được nồng độ này ta tiến hành như sau: Dùng pipet hút vào mỗi
ống eppendorf chứa 180 µl dịch bacteriocin để bổ sung 10 µl catalase và 10 µl proteinase K hoặc trypsin (tùy vào enzym nào mà chúng ta muốn thử). Trước khi cho một trong hai enzym này vào ta cần xử lý dịch bacteriocin bằng enzym catalase để loại trừ ảnh hưởng của Hydro peoxy (H2O2) trong khoảng 30 phút ở tủ ấm 370C, sau đó cho enzym proteinase K hoặc trypsin vào xử lý trong bể điều nhiệt 500C trong vòng 3 giờ.
Sau khi xử lý xong, tiến hành thử enzyme cũng bằng phương pháp khếch tán trên đĩa thạch. Hút 100µ l dịch bacteriocin thô đã được xử lý bởi enzyme vào giếng thạch, ủ đĩa ở tủ ấm trong 14-16 giờ thì kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng.
Các giếng trên một đĩa thạch được bố trí như sau :
+ Giếng số 1 : Dịch vi khuẩn sau ly tâm được điều chỉnh pH và giữ mát ở 2-40C. + Giếng số 2 : Dịch vi khuẩn không bổ sung enzym và đặt trong tủ ấm 370C. + Giếng số 3 : Dịch vi khuẩn đã xử lý enzym catalase + proteinase K.
+ Giếng số 4 : Dịch vi khuẩn chỉ xử lý enzym catalasẹ