từ ruột cá chim vây vàng
2.2.1.1.Phân lập vi khuẩn
• Pha loãng mẫu:
- Cân 5 g mẫu đã đồng nhất cho vào bình tam giác 100ml có chứa 45ml pepton 1% ta được mức pha loãng 10-1. Mẫu sẽ được tăng sinh trong 24h ở máy lắc.
- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml pepton 1% đã được hấp khử trùng. Hút 1ml dịch mẫu đã được lắc qua 24 giờ vào ống nghiệm pha loãng 10-1, rồi đưa lên máy Vortex để trộn đềụ Từ mức pha loãng 10-1, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9 ml pepton đã hấp khử trùng, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-2, tiếp tục làm tương tự, ta có các ống nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-3, 10-4, 10-5, 10-6,10-7, 10-8.
Hình 2.2. Quá trình phân lập vi sinh vật
• Cấy trang :
Môi trường TSA được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa 10-15ml. Lấy các ống nghiệm có mẫu pha loãng ở trên, mỗi ống lấy 0,1 ml mẫu cho vào các đĩa petrị Nhúng que trang vào cồn 960, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguộị Tiếp đến dùng que trang trang đều dịch mẫu lên bề mặt thạch. Trước
khi trang cần phải ghi rõ nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ lặp lại 2 đĩa petrị Hơ và khử trùng que trang sau mỗi lần trang dịch, mọi thao tác đều được tiến hành trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau khi trang xong, dùng giấy báo gói lại, lật ngược đĩa và nuôi trong tủ ấm ở 370C trong vòng 24 – 48 giờ thì tiến hành đếm, quan sát hình thái khuẩn lạc.
• Tách và thuần khiết khuẩn lạc:
Sau khi quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa cấy trang, ta tiến hành mô tả khuẩn lạc để tiến hành phân lập, thuần khiết các chủng bằng phương pháp cấy riạ Phương pháp này dựa trên nguyên lý que cấy được sử dụng nhiều lần hỗn hợp VSV cần phân lập trên khắp bề mặt môi trường đặc trong đĩa petrị Sau mỗi lần cấy ria, VSV sẽ bị tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng rẽ. Cách tiến hành như sau:
+ Nung đỏ đầu que cấy vòng, làm nguội trong không khí khoảng 15 giâỵ Cho vòng que cấy chấm vào một khuẩn lạc cần tinh sạch trên đĩa cấy trang.
+ Tay trái hé mở nắp hộp thạch. Đặt đầu que cấy vào 1 góc hộp thạch, chấm nhẹ để loại bớt tế bào một lần nữạ Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch theo đường ziczac. Xoay đĩa và tiếp tục vạch các đường ziczac sao cho không trùng lên nhau trên khoảng trống còn lại, nhằm tạo điều kiện cho các khuẩn lạc mọc rời nhau rạ Đậy nắp hộp. Khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá.
+ Các thao tác phải nhanh tay và làm trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy, đảm bảo vô trùng. Các bước cấy ria được minh họa theo Hình 2.3.
Sau các khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạch nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vị Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống. Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 370C.
• Tính vi khuẩn tổng số
Trong quá trình phân lập VK, ngay sau khi gieo cấy mẫu và ủ ở tủ ấm 370C trong 24-36 giờ các khuẩn lạc sẽ mọc lên trên các đĩa petri, lúc này ta tiến hành đếm tổng số khuẩn lạc trên các đĩa nàỵ Chú ý là chọn các đĩa petri có từ 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri có độ pha loãng khác nhau cần tuân thủ theo một quy luật hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc đếm được trên đĩa petri phải càng ít. Nếu kết quả không hợp lý, cần thực hiện lại các thí nghiệm.
Công thức tính: (CFU ml) d C C N / 2 2 1+ = Trong đó:
N – số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu ban đầu
C1, C2 - số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp Petri ở độ pha loãng đã chọn d – hệ số pha loãng mẫu