2.1.4.1. Môi trường phân lập vi khuẩn
a) Môi trường Alkaline Peptone Water (APW)
+ Pepton : 10 g + Natri clorua (NaCl) : 15 g + Nước cất : 1 lít + pH = 6.5 - 7.5
Hòa tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác dung tích 100 ml, mỗi bình 45 ml. Đậy nút bông, giấy bạc rồi đem hấp ở 1210C trong 15 phút. Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để sau khi khử trùng không bị bật nút rất dễ nhiễm VSV, tránh mất nước và làm pH thay đổị
b) Môi trường TSB
Hiện nay, môi trường TSB sử dụng là môi trường tổng hợp, thành phần các chất cho ở Bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần môi trường TSB tổng hợp (trong 1000ml)
STT Thành phần Khối lượng 1 Trypticase pepton 17 g 2 Phytone pepton 3 g 3 NaCl 5 g 4 K2HPO4 2,5 g 5 Glucose 2,5 g 6 Nước cất 1 l 7 pH (ở 250C) 7,3 ± 0,2
Hòa tan 30 g môi trường TSB tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đem rót môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và giấy bạc, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong thời gian 15 phút.
c) Môi trường TSA
Môi trường TSA được pha từ môi trường TSB có bổ sung thêm thạch agar. Nếu pha môi trường TSA để thử hoạt tính thì bổ sung thêm 20 g agar/ 1000ml (2%), không bổ sung muối sau đó rót vào mỗi bình tam giác 150 ml môi trường làm nút bông và giấy bạc, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong thời gian 15 phút.
2.1.4.2. Hóa chất và thuốc thử a) Dung dịch Glycerol a) Dung dịch Glycerol
Dung dịch glycerol được giữ trong lọ tối màu và bọc nắp bằng giấy bạc cẩn thận, bảo quản ở tủ lạnh. Trước khi giữ chủng cần hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong khoảng 15 phút.
b) Thuốc thử dùng để nhuộm Gram
• Thuốc nhuộm Tím Violet
- Tím violet : 1 g - Rượu ethylic : 1 g - Phenol tinh thể : 2g - Nước cất : 100 ml - Pha chế :
+ Hòa tan 1 g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1) + Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)
+ Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet
• Thuốc nhuộm Liugol
- Iod tinh thể : 1 g - KI : 2 g
- Nước cất : 200 ml
• Thuốc nhuộm Fuschin
- Fuschin kiềm : 1g - Rượu ethylic 95% : 10 ml - Phenol tinh thể : 5g - Nước cất : 100 ml - Pha chế:
+ Hòa tan Fuschin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1). + Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Quy trình thực hiện được sơ đồ hóa trong Hình 2.
Hình 2.1. Cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu trong đề tài
Mẫu (Ruột)
Phân lập vi khuẩn tổng số
Khuẩn lạc
Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin Cấy ria
Pha loãng Cấy trang
Bảo quản Xác định hoạt tính kháng khuẩn Thử enzym protease K và trypsin
Test một số đặc điểm sinh học các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin (hình thái khuẩn lạc, tế bào, nhuộm
Gram…)
Định danh
2.2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK biển có khả năng sinh bacteriocin từ ruột cá chim vây vàng từ ruột cá chim vây vàng
2.2.1.1.Phân lập vi khuẩn
• Pha loãng mẫu:
- Cân 5 g mẫu đã đồng nhất cho vào bình tam giác 100ml có chứa 45ml pepton 1% ta được mức pha loãng 10-1. Mẫu sẽ được tăng sinh trong 24h ở máy lắc.
- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml pepton 1% đã được hấp khử trùng. Hút 1ml dịch mẫu đã được lắc qua 24 giờ vào ống nghiệm pha loãng 10-1, rồi đưa lên máy Vortex để trộn đềụ Từ mức pha loãng 10-1, pha loãng ra ống nghiệm có nồng độ thấp hơn 10-2 bằng cách hút 1ml từ ống nghiệm 10-1 cho vào 9 ml pepton đã hấp khử trùng, rồi đưa lên máy vortex để trộn đều, thu được ống nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-2, tiếp tục làm tương tự, ta có các ống nghiệm có độ pha loãng mẫu 10-3, 10-4, 10-5, 10-6,10-7, 10-8.
Hình 2.2. Quá trình phân lập vi sinh vật
• Cấy trang :
Môi trường TSA được chuẩn bị, hấp khử trùng và phân phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa 10-15ml. Lấy các ống nghiệm có mẫu pha loãng ở trên, mỗi ống lấy 0,1 ml mẫu cho vào các đĩa petrị Nhúng que trang vào cồn 960, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguộị Tiếp đến dùng que trang trang đều dịch mẫu lên bề mặt thạch. Trước
khi trang cần phải ghi rõ nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ lặp lại 2 đĩa petrị Hơ và khử trùng que trang sau mỗi lần trang dịch, mọi thao tác đều được tiến hành trong điều kiện vô trùng trong tủ cấy, bên cạnh ngọn lửa đèn cồn. Sau khi trang xong, dùng giấy báo gói lại, lật ngược đĩa và nuôi trong tủ ấm ở 370C trong vòng 24 – 48 giờ thì tiến hành đếm, quan sát hình thái khuẩn lạc.
• Tách và thuần khiết khuẩn lạc:
Sau khi quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa cấy trang, ta tiến hành mô tả khuẩn lạc để tiến hành phân lập, thuần khiết các chủng bằng phương pháp cấy riạ Phương pháp này dựa trên nguyên lý que cấy được sử dụng nhiều lần hỗn hợp VSV cần phân lập trên khắp bề mặt môi trường đặc trong đĩa petrị Sau mỗi lần cấy ria, VSV sẽ bị tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng rẽ. Cách tiến hành như sau:
+ Nung đỏ đầu que cấy vòng, làm nguội trong không khí khoảng 15 giâỵ Cho vòng que cấy chấm vào một khuẩn lạc cần tinh sạch trên đĩa cấy trang.
+ Tay trái hé mở nắp hộp thạch. Đặt đầu que cấy vào 1 góc hộp thạch, chấm nhẹ để loại bớt tế bào một lần nữạ Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt thạch theo đường ziczac. Xoay đĩa và tiếp tục vạch các đường ziczac sao cho không trùng lên nhau trên khoảng trống còn lại, nhằm tạo điều kiện cho các khuẩn lạc mọc rời nhau rạ Đậy nắp hộp. Khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá.
+ Các thao tác phải nhanh tay và làm trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy, đảm bảo vô trùng. Các bước cấy ria được minh họa theo Hình 2.3.
Sau các khoảng thời gian thích hợp cấy ziczac ra đĩa petri để tinh sạch các chủng VSV, tiến hành tinh sạch nhiều lần. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy, kiểm tra độ thuần chủng của các khuẩn lạc và kiểm tra tế bào dưới kính hiển vị Khi được khuẩn lạc thuần nhất và tách rời trên đĩa thạch thì cấy vào ống nghiệm giữ giống. Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa peptri cấy rồi cấy vào ống nghiệm, mỗi khuẩn lạc cấy vào một ống (ghi kí hiệu đầy đủ để cho các bước nghiên cứu tiếp theo), đặt vào tủ ấm 370C.
• Tính vi khuẩn tổng số
Trong quá trình phân lập VK, ngay sau khi gieo cấy mẫu và ủ ở tủ ấm 370C trong 24-36 giờ các khuẩn lạc sẽ mọc lên trên các đĩa petri, lúc này ta tiến hành đếm tổng số khuẩn lạc trên các đĩa nàỵ Chú ý là chọn các đĩa petri có từ 25 đến 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri có độ pha loãng khác nhau cần tuân thủ theo một quy luật hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc đếm được trên đĩa petri phải càng ít. Nếu kết quả không hợp lý, cần thực hiện lại các thí nghiệm.
Công thức tính: (CFU ml) d C C N / 2 2 1+ = Trong đó:
N – số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu ban đầu
C1, C2 - số khuẩn lạc đếm được trên 2 hộp Petri ở độ pha loãng đã chọn d – hệ số pha loãng mẫu
2.2.1.2. Giữ giống và cấy chuyền:
• Giữ chủng trong ống nghiệm thạch nghiêng
- Mục đích: Giữ chủng trong một thời gian ngắn (1-2 tháng) phục vụ cho quá trình nghiên cứu .
- Cách tiến hành:
Sau khi tinh sạch xong ta chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên các đĩa petri cấy vào ống nghiệm thạch nghiêng. Tiến hành cấy ziczac trên ống thạch nghiêng để được giống thuần khiết. Các chủng VK đã được lựa chọn cấy trên môi trường thạch
nghiêng đặc hiệu để vào tủ ấm 370C. Sau 24-48 giờ khi VSV đã mọc tốt, các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 4-60C. Sau 1-2 tháng cấy chuyền lại một lần.
• Giữ chủng trong glyxerol
- Mục đích: Nhằm bảo quản giống được lâu dài (có thể đến hằng năm) phục vụ cho những công tác nghiên cứu tiếp tiếp theọ
- Cách tiến hành:
Dung dịch glyxerol được dùng để bảo quản các giống phân lập, được để trong chai tối trước khi sử dụng cần được đưa đi hấp khử trùng cùng với ống eppendorf để loại bỏ các VSV nhiễm vào giống cần bảo quản. Giống cần giữ được tiến hành hoạt hóa trong môi trường TSB từ 14-16 giờ nhằm để hoạt hóa chúng. Để giữ giống cần phối trộn glycerol và dung dịch VK sau hoạt hóa theo tỷ lệ 3/7 bằng cách : Hút 300 µl glyxerol vào ống eppendorf sau đó hút 700 µl dịch VK vàọ Votex nhẹ cho đều hỗn hợp, để vào tủ lạnh ở ngăn mát trong 3 giờ rồi đem bảo quản ở -700C.
2.2.1.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin
• Tiến hành thử tính đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đối với 2 vi khuẩn đích Bacillus B1.1 và Vibrio V1.1
- Mục đích: Thử tính đối kháng của VK phân lập từ ruột cá chim vây vàng đối với các VK đích, đây là những chủng VK gây bệnh thường gặp trên tôm, cá nuôị
- Nguyên lý: Sau khi nuôi dịch lỏng vi khuẩn phân lập trong 16-20 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch bacteriocin thô và chỉnh pH về 7 để loại bỏ tác dụng của một số axit hữa cơ do vi khuẩn tiết ra có trong dịch, sau đó tiến hành thử hoạt tính với các chủng chỉ thị. Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch. Ở phương pháp này, chủng VK thử nghiệm và chủng chỉ thị cùng được nuôi trên một môi trường, và tính đối kháng thể hiện ở việc chất ức chế của chủng thử nghiệm khuyếch tán vào môi trường và gây ức chế chủng chỉ thị. Sử dụng đĩa thạch đã nuôi cấy chủng chỉ thị, sau đó tạo giếng trên thạch bằng cách đục các giếng, tra dịch của chủng thử nghiệm đã được ly tâm trước đó vào và ủ ở nhiệt độ thích hợp. Phương pháp này thích hợp đối với kiểm tra những khuẩn lạc riêng rẽ và áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu về mặt di truyền.
- Cách tiến hành : Các bước tiến hành được trình bày ở Hình 2.4
Hình 2.4. Quy trình thử tính đối kháng của dịch VK phân lập đối với các chủng chỉ thị (Bacillus B1.1 và Vibrio V1.1)
• Giải thích quy trình :
Dịch VK sau khi ta đã nuôi cấy qua đêm, sau đó hút 1.5 ml dịch VK vào ống eppendorf để ly tâm 6000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, ở 40C để loại bỏ sinh khối tế bào và thu dịch nổi, hút 1ml dịch nổi và đo pH ban đầụ Lưu ý là thao tác hút cẩn thận không sinh khối tế bào ở đáy có thể hòa trở lại vào dịch gây nên hiện tượng phát triển của chủng vi khuẩn này xung quanh vòng các giếng đục lỗ. Sau đó mới tiến hành điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 2N hoặc HCl 1N để đưa về pH
Dịch vi khuẩn nuôi cấy ở 370C trong 14-16 giờ
Hút 1.5 ml dịch vi khuẩn vào ống eppendorf đã hấp khử trùng
Ly tâm dịch ở 6000 vòng/phút, trong 30 phút, ở 40C
Dịch bacteriocin thô
Hút 1 ml dịch bacteriocin thô đã loại bỏ cặn và tiến hành điều chỉnh pH của dịch bacteriocin thô, đưa về pH = 7
Thử hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Sau 14-16 giờ thu nhận và đo kích thước vòng kháng khuẩn
= 7. Bước này nhằm mục đích loại bỏ sự ảnh hưởng của một số acid hữu cơ tiết ra có thể làm ta nhầm lẫn trong việc xác định bacteriocin của vi khuẩn phân lập tiết rạ
Sau đó tiến hành thử hoạt tính bằng phương pháp khếch tán trên thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng giữa VSV kiểm định và VSV chỉ thị. Đun nóng môi trường TSA, lắc đềụ Tiếp đó, đổ 20-25 ml môi trường vào đĩa petri, ta để thạch đông hoàn toàn thì tiến hành cấy trang các chủng VK chỉ thị lên trên bề mặt thạch bằng cách hút 100 µl dịch VK chỉ thị đã tiến hành nuôi lắc trước đó cho vào đĩa thạch môi trường và trang đều lên bề mặt. Sau đó hút 100 µl dịch bacteriocin thô vào các giếng thạch. Ủ đĩa ở 370C trong 14-16 giờ thì kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng. Hoạt tính được biểu thị bằng kích thước vòng kháng và được tính như sau : H =D d−
Trong đó :
- H : hiệu số vạch phân giải (mm)
- D : đường kính vòng phân giải+ đường kính lỗ đục (mm) - d : đường kính lỗ đục (mm)
• Xác định bản chất protein của dịch bateriocin bằng enzym proteinase K và trypsin
- Mục đích: Kiểm tra dịch ngoại bào các chủng vi khuẩn phân lập có bản chất là protein của một bacteriocin không.
- Nguyên lý: bacteriocin có bản chất protein nên dưới tác dụng của enzym proteinase K, enzym trypsin thì sẽ bị thủy phân, mất tính kháng đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị.
- Bố trí thí nghiệm:
Sử dụng dịch VK đã ly tâm và điều chỉnh pH bằng NaOH 2N hoặc bằng HCl 3N (các thao tác chuẩn bị dịch đã nêu rõ trước đó).
Enzym proteinase K và trypsin được pha sẵn trước đó với nồng độ 20 mg/ml được bảo quản lạnh, khi cần dùng thì mới lấy ra hút nhanh cho vào dịch bacteriocin thô. Tỷ lệ enzym / dịch ngoại bào của VK phải đạt nồng độ cuối cùng là 1 mg/1 ml dịch VK. Để đạt được nồng độ này ta tiến hành như sau: Dùng pipet hút vào mỗi
ống eppendorf chứa 180 µl dịch bacteriocin để bổ sung 10 µl catalase và 10 µl proteinase K hoặc trypsin (tùy vào enzym nào mà chúng ta muốn thử). Trước khi cho một trong hai enzym này vào ta cần xử lý dịch bacteriocin bằng enzym catalase để loại trừ ảnh hưởng của Hydro peoxy (H2O2) trong khoảng 30 phút ở tủ ấm 370C, sau đó cho enzym proteinase K hoặc trypsin vào xử lý trong bể điều nhiệt 500C trong vòng 3 giờ.
Sau khi xử lý xong, tiến hành thử enzyme cũng bằng phương pháp khếch tán trên đĩa thạch. Hút 100µ l dịch bacteriocin thô đã được xử lý bởi enzyme vào giếng thạch, ủ đĩa ở tủ ấm trong 14-16 giờ thì kiểm tra sự tạo thành vòng kháng khuẩn và đo kích thước vòng kháng.
Các giếng trên một đĩa thạch được bố trí như sau :
+ Giếng số 1 : Dịch vi khuẩn sau ly tâm được điều chỉnh pH và giữ mát ở 2-40C. + Giếng số 2 : Dịch vi khuẩn không bổ sung enzym và đặt trong tủ ấm 370C. + Giếng số 3 : Dịch vi khuẩn đã xử lý enzym catalase + proteinase K.
+ Giếng số 4 : Dịch vi khuẩn chỉ xử lý enzym catalasẹ
2.2.2. Xác định một số đặc điểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin phân lập từ ruột cá chim vây vàng sinh bacteriocin phân lập từ ruột cá chim vây vàng
2.2.2.1. Cấy điểm xác định hình thái khuẩn lạc và nhuộm Gram
• Xác định hình thái khuẩn lạc bằng phương pháp cấy điểm
Nhằm mục đích miêu tả đầy đủ hơn hình dáng, kích thước cũng như màu sắc các khuẩn lạc được rõ hơn ta tiến hành cấy điểm. Chuẩn bị môi trường TSA trên các đĩa petri, hơ nóng que cấy điểm trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội dùng đĩa chứa