1.3.2.1. Dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản
Tình hình NTTS ngày càng được mở rộng, phát triển mạnh, mang lại lợi nhuận cao và đạt được nhiều thành tựu to lớn. Nhưng bên cạnh đó ngành NTTS đang phải gánh chịu thiệt hại năng nề do tình hình dịch bệnh trong NTTS.
Ngành nuôi biển mới phát triển thì cũng bị dịch bệnh gây thiệt hại nặng nề, bên cạnh đó ô nhiễm môi trường và trầm tích đáy tăng dần. Đỉnh điểm là dịch bệnh trên tôm hùm xảy ra vào cuối năm 2007, gây thiệt hại hàng tỷ đồng cho các hộ nuôi trồng vì tôm hùm dịch bệnh chết và giá cả giảm nhanh. Những hộ dân nuôi tôm ở Cam Ranh (Khánh Hòa), Phú Yên bị thiệt hại nặng nề nhất.
Sau đợt dịch bệnh sữa năm 2007 gây chết hàng loạt tôm hùm, từ đó đến nay dịch bệnh trên tôm hùm năm nào cũng xuất hiện, mức độ thiệt hại khoảng 15% sản lượng. Từ tháng 11 đến nay, dịch bệnh bùng phát mạnh trở lại với mức độ thiệt hại rất lớn, từ 30- 50 % tôm mắc bệnh.
Tại Khánh Hoà có 20.000 lồng nuôi tôm hùm, sản lượng hàng năm đạt trên 900 tấn. Các bệnh sữa, đỏ thân, mang đen, lột xác không hoàn toàn đã xuất hiện rải rác với mức độ thiệt hại từ 10- 15%. Cũng như ở Phú Yên, từ cuối năm 2011 hiện tượng tôm hùm chết hàng loạt tại một số vùng nuôi tập trung, thiệt hại hàng vạn con; chủ yếu do bệnh sữa (chiếm 83%), thiệt hại gần 40 tỷ đồng. Tương tự, tỉnh Bình Định có 532 lồng tôm hùm với 40.000 con. Đợt dịch này trên 2.000 con trọng lượng từ 0,5- 1kg đã bị chết.
Ngoài ra một số đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao như cá chẽm, cá chim trắng vây vàng… cũng bị thiệt hại do dịch bệnh.
Theo báo cáo của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II, từ đầu năm 2012 đến nay, tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi tiếp tục bùng phát và gây thiệt hại nặng nề ở nhiều địa phương vùng ĐBSCL như: Trà Vinh, Bến Tre, Kiên Giang, Bạc Liêu, Sóc Trăng. Trong đó, Trà Vinh và Kiên Giang là 2 tỉnh có diện tích nuôi thâm canh và bán thâm canh bị thiệt hại nặng nhất. Tôm nuôi bị thiệt hại chủ yếu do bệnh đốm trắng, hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô dưới vỏ và một số trường hợp không xác định được bệnh.
Nguyên nhân gây ra bệnh trong nuôi trồng cá biển bao gồm: bệnh do nấm, ký sinh trùng, do virus, do VK. Hiện nay, bệnh do VK gây thiệt hại rất lớn cho nghề ương nuôi cá thương phẩm. Nhiều bệnh trên cá nuôi lồng bè trên biển do VK đã được ghi nhận: bệnh đốm trắng ở thận trên cá giò nuôi thương phẩm, bệnh Vibriosis, bệnh mòn vây cụt đuôi và bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu ở cá mú, cá chẽm, cá giò (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2008). Trong các bệnh do VK gây ra thì nhóm Vibrio spp gây bệnh đang được chú ý hơn cả vì tốc độ lây lan và mức độ ảnh hưởng nghiêm trọng của chúng.
Vibrio- vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản
Bệnh vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do vi khuẩn Vibrio spp gây rạ Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh vibriosisở động vật thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004).
Vibrio là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đối với động vật thủy sản. V. anguillarum, V.salmonicida, và V.vulnificus là ba trong số những loài gây bệnh chính cho vài loài cá (Bùi Quang Tề , Phan Thị Vân và cộng sự, 1998). Số lượng chết gây ra bởi Vibrio trên cá và các loài sò hến là rất phổ biến trong giai đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột ngột, đôi khi dẫn đến chết toàn bộ (Thompson và cộng sự, 2004).
Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá lồng trên biển phát triển mạnh, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004). Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn, sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ.
Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang được nuôi phổ biến ở nhiều quốc gia châu Á, như cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thường bị bệnh này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển (Liopo và cộng sự, 2001). Bệnh thường thể hiện các dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâụ Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá. Cá bị bệnh có thể gây chết hàng loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004). Từ cá bệnh ở Việt Nam người ta đã phân lập được một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, và V. anguillarum (Phan Thị Vân và cộng sự, 2000). Ngoài ra có những báo cáo khác về bệnh do Vibrio ở cá như vi khuẩn V. anguillarum, V. vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá trình, V. salmonicida gây bệnh ở cá vùng nước lạnh (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004).
Tình hình bệnh dịch và nguyên nhân gây bệnh ở trên các loài cá nuôi thương phẩm như cá mú, cá chẽm, cá giò đã được nhiều nghiên cứu công bố. Tuy nhiên do cá chim vây vàng mới được đưa vào nuôi thương phẩm trong thời gian gần đây nên chưa có nghiên cứu cụ thể về dịch bệnh được công bố, nhưng qua thực tiễn nuôi cá chim vây vàng ở lồng bè trên biển, đã quan sát thấy số lượng cá bị hao hụt do bệnh tật là tương đối lớn. Các nhà khoa học cũng đã tiến hành thu mẫu cá chim trắng vây vàng bị bệnh đem về phân lập các chủng gây bệnh, kết quả là có rất nhiều vi khuẩn thuộc Vibrio spp đã được phân lập, đây là một cơ sở để kiểm tra và xem xét các tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên loài cá này trong tương laị Để làm sáng tỏ vấn đề này thì cần các nghiên cứu cụ thể để đánh giá cũng như đưa ra các biện pháp khắc phục để nghề nuôi thương phẩm cá chim vây vàng được phát triển mạnh (Võ Văn Nha, Viện nghiên cứu NTTS III, 2012).
1.3.2.2. Một số vấn đề môi trường trong nuôi trồng thủy sản
NTTS mang lại nhiều lợi ích kinh tế nhưng cũng để lại hậu quả nặng nề về môi trường nếu không được quản lý một cách chặt chẽ. Có rất nhiều mối quan tâm về môi trường trong NTTS như: Vấn đề quy hoạch không phù hợp và hậu quả là các loại hình NTTS gây ảnh hưởng lẫn nhau do vị trí các trại nuôi không phù hợp; sự mất đi đáng kể rừng ngập mặn và vùng đất ngập nước từ việc chuyển đổi các diện tích ven biển và các cửa sông; các rủi ro về dịch bệnh và sự bùng phát dịch bệnh, sự ô nhiễm môi trường do NTTS...
Trong các vấn đề đó thì ô nhiễm môi trường do NTTS là một trong những vấn đề nổi cộm nhất và hiện nay được xã hội hết sức quan tâm. Ô nhiễm môi trường trong NTTS chủ yếu là ô nhiễm chất thải rắn và ô nhiễm nước. Chất thải trong nuôi trồng thủy sản là bùn thải chứa phân của các loài thủy sản tôm cá, các nguồn thức ăn dư thừa thối rữa bị phân hủy, các chất tồn dư của các loại vật tư sử dụng trong nuôi trồng như: hóa chất, vôi và các loại khoáng chất Diatomit, Dolomit, lưu huỳnh lắng đọng, các chất độc hại có trong đất phèn Fe2+, Fe3+, Al3+, SO42-, các thành phần chứa H2S, NH3... là sản phẩm của quá trình phân hủy yếm khí ngập nước tạo thành, nguồn bùn phù sa lắng đọng trong các ao nuôi trồng thủy sản thải ra hàng năm trong quá trình vệ sinh và nạo vét ao nuôị Sự phì dưỡng của hệ sinh thái xung quanh do hàm lượng nito và phospho quá cao, gây lắng đọng trầm tích và thiếu oxy ở đáy và khu vực xung quanh các lồng nuôi, chất lượng nước sẽ xấu đi do tích tụ chất thảị Sự nở hoa của thực vật phù du có thể dẫn đến sự sinh sôi nảy nở của các loài tảo độc và có thể phát triển thành thủy triều đỏ như trong trường hợp ở đảo Cát Bà có tác động tiêu cực ngược trở lại nghề nuôi cá lồng (Nguyễn và cộng sự, 2004). Chất lượng nước bị suy giảm do NTTS đã dẫn đến hàm lượng NH3 và H2S cao hơn trong tầng nước đáy và được coi là nguyên nhân của các đợt các loài nuôi chết hàng loạt trong các năn gần đây (Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 1, 6/2006). Ô nhiễm nguồn nước cũng làm tăng mâu thuẫn giữa các ngành sản xuất khác nhau, thậm chí ngay trong chính nghề NTTS.
Bên cạnh ô nhiễm nguồn nước, sử dụng bất hợp lý nguồn nước cũng tác động tiêu cực đến môi trường và các đối tượng sử dụng tài nguyên khác. Ví dụ như, khai thác nước ngầm ở các tỉnh miền Trung để khống chế mặn trong các ao nuôi tôm trên cát có ảnh hưởng cực kỳ bất lợi đến các ngành khác (như du lịch) và đang đe dọa đến sinh kế của các cộng đồng cư dân dọc ven biển do làm giảm nguồn nước ngọt sử dụng cho con người và sản xuất nông nghiệp. Trên thực tế, nguồn nước ngầm rất dễ bị tổn thương và dễ bị nhiễm bẩn. Sự xâm thực của nước mặn là một hậu quả không thể tránh khỏi của quản lý nước ngầm kém và chắc chắn tác động nghiêm trọng đến đời sống xã hộị
Với đặc thù là có dòng chảy biến động lớn nên NTTS trên biển có thể gây ô nhiễm môi trường trên diện rộng và rất khó khắc phục. Vì vậy, để phát triển hiệu quả ngành NTTS nói chung và nghề nuôi biển nói riêng về mặt kinh tế và môi trường thì cần có các biện pháp quản lý, quy hoạch và phát triển các vùng nuôi một cách bền vững.
CHƯƠNG IỊ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu
2.1.1. Mẫu cá chim vây vàng
Mẫu cá chim vây vàng được lấy từ các lồng nuôi cá chim vây vàng tại Vũng Ngán - Nha Trang - Khánh Hòạ
Sau khi mua cá về tiến hành xử lý mẫu bằng cách mổ cá và thu lấy phần ruột bằng dụng cụ (dao, banh, giấy bạc… ) vô trùng. Sau đó mẫu được cho vào túi PE và đưa đi dập mẫu trong vòng 2-3 phút và đưa vào tăng sinh trong dung dịch peptone 1% vô trùng ở điều kiện tủ ấm 370C trong vòng 24 giờ.
Bảng 2.1. Mẫu cá chim vây vàng
STT Ngày lấy mẫu Số lượng cá Khối lượng cá trung
bình (g)
1 10/3/2012 3 450 ± 5
2 15/4/2012 3 500 ± 5
2.1.2. Chủng vi khuẩn chỉ thị
Các chủng Bacillus B1.1 và Vibrio V1.1 được lấy từ bộ sưu tập VSV của Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nha Trang.
Chủng Bacillus B1.1và Vibrio V1.1 được lấy từ ống eppendorf giữ chủng trong tủ đông sâu -700C, sau đó cấy trang lên môi trường TSA, bỏ tủ ấm 370C trong 24 giờ. Lúc kiểm tra vòng kháng của dịch vi khuẩn thì đem nuôi cấy trên môi trường TSB, pH 6.5-7.5, lắc 180 vòng/phút trong vòng 12-14 giờ.
Đối với các chủng này sau khi cấy trang lên môi trường thích hợp cần giữ chủng trong thạch nghiêng để cần dùng trong thời gian thí nghiệm. Bên cạnh đó cũng cần giữ chủng trong dung dịch gryxerol 30% để giữ chủng trong một thời gian lâu hơn nhằm duy trì đầy đủ số lượng các chủng này cho Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phục vụ nghiên cứu sau nàỵ
2.1.3. Thiết bị chuyên dụng
- Máy ly tâm (Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ) - Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)
- Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ) - Máy lắc (GFL 3005, Đức)
- Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha) - Tủ sấy (Binder, Đức)
- Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan) - Lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc)
- Máy Vortex (Thermolyne, Mỹ)
2.1.4. Hóa chất, môi trường và thuốc thử 2.1.4.1. Môi trường phân lập vi khuẩn 2.1.4.1. Môi trường phân lập vi khuẩn
a) Môi trường Alkaline Peptone Water (APW)
+ Pepton : 10 g + Natri clorua (NaCl) : 15 g + Nước cất : 1 lít + pH = 6.5 - 7.5
Hòa tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình tam giác dung tích 100 ml, mỗi bình 45 ml. Đậy nút bông, giấy bạc rồi đem hấp ở 1210C trong 15 phút. Việc bao gói phải thật kín và cẩn thận để sau khi khử trùng không bị bật nút rất dễ nhiễm VSV, tránh mất nước và làm pH thay đổị
b) Môi trường TSB
Hiện nay, môi trường TSB sử dụng là môi trường tổng hợp, thành phần các chất cho ở Bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần môi trường TSB tổng hợp (trong 1000ml)
STT Thành phần Khối lượng 1 Trypticase pepton 17 g 2 Phytone pepton 3 g 3 NaCl 5 g 4 K2HPO4 2,5 g 5 Glucose 2,5 g 6 Nước cất 1 l 7 pH (ở 250C) 7,3 ± 0,2
Hòa tan 30 g môi trường TSB tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đem rót môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và giấy bạc, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong thời gian 15 phút.
c) Môi trường TSA
Môi trường TSA được pha từ môi trường TSB có bổ sung thêm thạch agar. Nếu pha môi trường TSA để thử hoạt tính thì bổ sung thêm 20 g agar/ 1000ml (2%), không bổ sung muối sau đó rót vào mỗi bình tam giác 150 ml môi trường làm nút bông và giấy bạc, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong thời gian 15 phút.
2.1.4.2. Hóa chất và thuốc thử a) Dung dịch Glycerol a) Dung dịch Glycerol
Dung dịch glycerol được giữ trong lọ tối màu và bọc nắp bằng giấy bạc cẩn thận, bảo quản ở tủ lạnh. Trước khi giữ chủng cần hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong khoảng 15 phút.
b) Thuốc thử dùng để nhuộm Gram
• Thuốc nhuộm Tím Violet
- Tím violet : 1 g - Rượu ethylic : 1 g - Phenol tinh thể : 2g - Nước cất : 100 ml - Pha chế :
+ Hòa tan 1 g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1) + Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)
+ Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet
• Thuốc nhuộm Liugol
- Iod tinh thể : 1 g - KI : 2 g
- Nước cất : 200 ml
• Thuốc nhuộm Fuschin
- Fuschin kiềm : 1g - Rượu ethylic 95% : 10 ml - Phenol tinh thể : 5g - Nước cất : 100 ml - Pha chế:
+ Hòa tan Fuschin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1). + Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Quy trình thực hiện được sơ đồ hóa trong Hình 2.
Hình 2.1. Cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu trong đề tài
Mẫu (Ruột)
Phân lập vi khuẩn tổng số
Khuẩn lạc
Tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh bacteriocin Cấy ria
Pha loãng Cấy trang
Bảo quản Xác định hoạt tính kháng khuẩn Thử enzym protease K và trypsin
Test một số đặc điểm sinh học các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin (hình thái khuẩn lạc, tế bào, nhuộm
Gram…)
Định danh
2.2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK biển có khả năng sinh bacteriocin từ ruột cá chim vây vàng từ ruột cá chim vây vàng
2.2.1.1.Phân lập vi khuẩn
• Pha loãng mẫu:
- Cân 5 g mẫu đã đồng nhất cho vào bình tam giác 100ml có chứa 45ml pepton 1% ta được mức pha loãng 10-1. Mẫu sẽ được tăng sinh trong 24h ở máy lắc.
- Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml pepton 1% đã được hấp khử trùng. Hút 1ml dịch mẫu đã được lắc qua 24 giờ vào ống nghiệm pha loãng 10-1, rồi đưa lên máy Vortex để trộn đềụ Từ mức pha loãng 10-1, pha loãng