e. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain
2.2.5Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl
2.2.5.1 Nguyên tắc:
Chất đạm khi đem vơ cơ hĩa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulfat, khi cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phĩng thích ra amoniac theo phương trình như sau:
(NH4)2SO4 + NaOH ---> 2NH3 + H2O + Na2SO4
Lượng amoniac phĩng thích ra sẽ được hơi nước lơi cuốn bằng một dụng cụ là máy Parnas – Wargner và được dẫn đến một bình tam giác cĩ chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây, cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phĩng thích ra, cĩ nghĩa là xác định hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.
2NH3 + H2O + H2SO4 ---> (NH4)2SO4 + H2O
2.2.5.2 Cách tính:
N = 1.4*V (mg/ml) Trong đĩ:
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
N: Số gam đạm tổng số cĩ trong 1 lít nguyên liệu lỗng hay 1kg nguyên liệu rắn.
V = V0 – V
V0: thể tích NaOH N/100 mẫu thử khơng. V: thể tích NaOH N/100 mẫu thử thật.
2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen)[1, 4] 2.2.6.1 Nguyên tắc 2.2.6.1 Nguyên tắc
Trong phân tử acid amin, peptid, protein cĩ một đầu chức là nhĩm –COOH như là một acid cịn đầu kia là nhĩm –NH2 được xem như là một base, cịn các amin tự do cũng như amoniac khi hịa tan thường ở dưới dạng amonium NH4+ kết hợp với một anion thường là clorur, sulfat, phosphat…
Như vậy khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol, formol sẽ tác dụng lên nhĩm -NH2 để tạo thành phức chất methylen (mono, tri hoặc hexamethylen). HOOC C R NH2 H + HCHO HOOC C R N H CH2 + H2O + HCHO R N CH2 + H2O RNH4+Cl- + HCl
Sản phẩm của phản ứng là hợp chất methylen và một chức –COOH tự do (trong trường hợp acid amin) hoặc HCl (trong trường hợp amin tự do hoặc amoniac). Nên ta cĩ thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác định một cách gián tiếp được lượng –NH2.
Khi hàm lượng đạm formol khơng tăng theo thời gian cĩ nghĩa là phản ứng thủy phân đã kết thúc
2.2.6.2 Tiến hành
Trung hịa formol ½: lấy 50ml formol ½, thêm vào đĩ vài giọt phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng nhạt, ta được formol ½ đã trung hịa.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha lỗng từ 5 đến 20 lần (trong đề tài này chúng tơi tiến hành pha lỗng mẫu 10 lần) thêm vào đĩ 10ml dung dịch formol ½ đã trung hịa và vài giọt phenolphtalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hồn tồn, sau đĩ định phân bằng NaOH x N/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu hồng.
Thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử khơng (thay dung dịch đạm bằng nước cất) lấy trị số trung bình.
2.2.6.3 Cách tính
Số gam đạm formol cĩ trong 1 lít nguyên liệu = 1.4*V (g/lít) Trong đĩ:
V = V – V0
V0: thể tích NaOH N/10 mẫu thử khơng. V: thể tích NaOH N/10 mẫu thử thật.
2.2.7 Xác định đạm amoniac[1, 4] 2.2.7.1 Nguyên tắc
Trong nguyên liệu chứa đạm thường cĩ một loại đạm nằm dưới dạng “vơ cơ” (muối amonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl của acid amin), vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này khơng cần cho cơ thể, nếu cĩ sự hiện diện của nĩ với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là “mất phẩm chất’.
Những loại đạm này thường cĩ tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với MgO thì những loại đạm này sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lơi cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid. Sau đĩ đem định phân lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm này.
2(NH4)+ + Mg(OH)2 ---> 2NH3 + 2H2O + Mg2+ 2NH3 + H2SO4 ----> (NH4)2SO4
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
2.2.7.2 Tiến hành
Lấy 50ml dung dịch nguyên liệu đã pha lỗng 20 lần (hoặc cân chính xác một lượng m gam nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho đồng nhất) cho vào trong bình cầu 500ml, thêm vào đĩ 150ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, tiếp tục thêm vào bình cầu 5g MgO, dung dịch phải cĩ màu hồng nhạt, đậy nút ngay để tránh amoniac bay ra, lắc đều, đun sơi và hơi nước được chưng cất sang một bình tam giác cĩ chứa sẵn 10ml H2SO4 N/10 và vài giọt thuốc thử Tashiro, đầu nhọn của ống sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H2SO4 N/10. Chưng cất trong 15-20 phút kể từ khi dung dịch trong bình cầu sơi. Sau 15-20 phút chất đạm amoniac sẽ được hấp thụ vào dung dịch H2SO4. Lấy bình tam giác ra (rửa đầu ống sinh hàn trước khi lấy ra).
Định phân lượng acid dư bằng NaOH cĩ chuẩn độ là x N/10 từ màu xanh tím sang màu xanh xám, nếu dư NaOH thì chuyển thành màu xanh ve chai. Thực hiện ba lần thử thật và ba lần thử khơng.
2.2.7.3 Cách tính
Số gam đạm NH3 cĩ trong 1 lít nguyên liệu = (1.4*V)/2.5
V = (Vt – V0) là lượng NaOH tương đương với lượng đạm phĩng thích đã được hấp thụ trong H2SO4.
2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng với xúc tác papain thơ.[15, 27] với xúc tác papain thơ.[15, 27]
2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo:
Sử dụng dung mơi eter dầu hỏa: cho dung mơi vào bánh dầu đậu phộng đã xay nhuyễn với tỷ lệ khối lượng dung mơi trên cơ chất là 3:2. Khuấy đều trong 3 giờ ở 70oC, sau đĩ lọc bỏ dung mơi (tiến hành 3 lần). Sau đĩ cho nước vào với tỷ lệ trên sản phẩm là 2:1, khuấy đều, đem lọc. Thực hiện sự rửa này 7 lần. Sản phẩm thu được đem sấy khơ ta được bánh dầu đậu phộng đã loại béo.
2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng[5, 30, 31, 37]
Phản ứng thủy phân được thực hiện tại tỉ lệ của bánh dầu đậu phộng với dung dịch đệm phosphate là 1:10. Cân 5g bánh dầu đậu phộng đã loại béo cho vào
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
erlen 100ml, thêm vào 50ml dung dịch đệm phosphate 0.1M. Bánh dầu đậu phộng được trộn với dung dịch đệm phosphate để đạt được pH mong muốn, hỗn hợp sau đĩ được gia nhiệt và khuấy từ liên tục. Khi phản ứng đạt đến nhiệt độ cần khảo sát, cho enzyme vào với tỉ lệ thích hợp, phản ứng được tiến hành trong 26 giờ. Sau mỗi 2 giờ phản ứng, lấy 0.1 gam dịch thủy phân từ erlen trên, thêm nước sơi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch, đem lọc. Hút 10ml dịch lọc đem xác định hàm lượng đạm formol theo phương pháp Sorensen, phần dung dịch cịn lại trong bình định mức dùng để xác định lượng protein theo phương pháp Lowry.
2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân[39]
Papain cĩ tính chất của endopeptidase thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng chủ yếu thành peptide theo phản ứng sau:
R1 N C H H R3 C O N H C R4 C H R2 O HOH + N C H H R3 C O R1 OH H2N C R4 CO R2 H +
Ngồi ra, papain cịn cĩ tính chất của exopeptidase thủy phân các peptide thành các acid amin theo phản ứng sau:
H2N C H R2 C O N H C R3 C H R1 O HOH + H2N C H R3 C O OH H2N C R4 CO R1 H +
Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%) được tính dựa trên tỉ lệ hàm lượng acid amin hịa tan trong nước của dung dịch sau phản ứng so với hàm lượng protein ban đầu được xác định thơng qua hàm lượng nitơ tổng.
Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo cơng thức như sau: 100 * P G H Trong đĩ:
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
G: hàm lượng acid amin tan của dung dịch sau thủy phân xác định theo phương pháp Lowry.
P: hàm lượng protein ban đầu trong bánh dầu đậu phộng xác định theo phương pháp Kjeldahl.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KHẢO SÁT LƢỢNG NHỰA Ở QUẢ ĐU ĐỦ
Chúng tơi đã tiến hành khảo sát lượng nhựa ở ba loại quả (quả non, quả già xanh, quả gần chín) ở trên cùng một lồi và cùng một phương pháp làm khơ. Kết quả được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Hàm lƣợng phần trăm của nhựa đu đủ trong các loại quả khác nhau.
Loại quả Khối lượng quả (g)
Khối lượng nhựa lấy (g)
Tỉ lệ nhựa thơ trên quả (%) Quả non (dưới 40 ngày tuổi) 120 0.2576 0.21 Quả già xanh (50-100 ngày tuổi) 580 1.5153 0.26 Quả gần chín (100-120 ngày tuổi) 1700 3.0292 0.18
Nhận xét: lượng papain thơ thu được ở quả già xanh cao hơn so với quả non và quả gần chín đồng thời chiếm hàm lượng khá cao. Qua kết quả này, chúng tơi nhận thấy thời gian thích hợp để thu nhận nhựa thơ là khi quả đu đủ được 50 – 100 ngày tuổi.
3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SƠ CHẾ NHỰA TƢƠI
Nhựa tươi được làm khơ ngay, ở nhiệt độ nhỏ hơn 50oC bằng các phương pháp khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Các phƣơng pháp làm khơ nhựa đu đủ
Phương pháp làm khơ Hình thức cảm quan Phơi nắng 1-2 nắng Vĩn cục,vàng nâu Sấy nĩng, cĩ quạt giĩ 24 giờ Vĩn cục, vàng nhạt
Đơng khơ chân khơng 8 giờ Vẩy mỏng, ĩng ánh và trắng sáng Nhận xét:
Chất lượng papain thơ thu được từ các phương pháp xử lý khác nhau rất khác nhau. Hình thức cảm quan phản ánh rõ chất lượng của sản phẩm: màu càng thẫm chất lượng càng kém.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Tuy cĩ nhiều phương pháp khác nhau để làm khơ nhựa tươi nhưng phương pháp đơng khơ chân khơng là phương pháp hiệu quả nhất và ít ảnh hưởng đến chất lượng nhựa. Do đĩ, tồn bộ nhựa tươi được đơng khơ chân khơng để loại nước và nhựa sau đơng khơ được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Từ 100ml dung dịch nhựa tươi, chúng tơi tiến hành đơng khơ trong 8 giờ và thu được 5 gam chế phẩm đơng khơ.
3.3 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN THU NHẬN PAPAIN TỪ NHỰA KHƠ
Nhựa tươi sau khi đã đơng khơ chân khơng, chúng tơi tiến hành sơ chế bằng dung mơi hữu cơ được làm lạnh để loại bỏ các tạp chất. Sản phẩm sau quá trình sơ chế được chạy điện di để phân tích sơ bộ thành phần protein. Kết quả chạy điện di của sản phẩm sau giai đoạn sơ chế được trình bày trong hình 3.1a:
Hình 3.1a. Điện di đồ của nhựa khơ ở trái non sơ chế bằng dung mơi etanol
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
1 – thang protein chuẩn
2 – nhựa đu đủ non đơng khơ sơ chế bằng etanol
Nhận xét: quá trình sơ chế bằng dung mơi cịn lẫn khá nhiều protein tạp, do đĩ chúng tơi tiến hành qui trình tinh chế với các phân đoạn khác nhau để tinh sạch protein. Đồng thời, chúng ta cũng dễ dàng nhận thấy rằng trong vạch điện di của nhựa đu đủ non khơng cĩ xuất hiện enzyme papain do đĩ chúng tơi tiến hành lấy nhựa trên trái trưởng thành để thu nhận papain. Điều này hồn tồn phù hợp với các nghiên cứu trước đây về enzyme trong nhựa đu đủ: enzyme papain chỉ hình thành trong giai đoạn trưởng thành của trái.
Tinh chế:
Tiến hành tinh chế papain từ nhựa đơng khơ theo phương pháp đã trình bày trong phần thực nghiệm, từ 90 gam nhựa khơ ban đầu chúng tơi thu được 1g papain. Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.1b:
Hình 3.1 b. Điện di đồ của chế phẩm Merk và papain tinh chế từ nhựa đu đủ đơng khơ.
1- Thang protein chuẩn 2- Chế phẩm Merck 3 - papain
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
3.4 PHƢƠNG PHÁP LOWRY XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG PROTEIN
Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sĩng 750nm của các ống nghiệm cĩ nồng độ albumin từ 50 – 250mg/ml được trình bày trong bảng 3.3 (phụ lục 1)
Bảng 3.3. Mật độ quang của albumin ở bƣớc sĩng 750nm
Mẫu 01 02 03 04 05
Nồng độ Albumin
(mg/ml) 50 100 150 200 250
Độ hấp thu quang OD
(AU) 0.0432 0.0648 0.1192 0.135 0.1942 Từ kết quả trên, vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang ∆OD (AU) theo nồng độ protein chuẩn (mg/ml) theo hình 3.2 với phương trình đường chuẩn là y = 0.0007x – 0.0004
Hình 3.2. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ albumin.
Cách tính
Từ phương trình đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein. Từ đĩ suy ra nồng độ của protein trong nguyên liệu là x (mg/ml)
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
m n x
M *0.001* (mg/g)
với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha lỗng (mg/ml). n: hệ số pha lỗng
m: khối lượng nguyên liệu lấy phân tích (g)
3.5 PHƢƠNG PHÁP ANSON XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE
Kết quả đo mật độ quang ∆OD ở bước sĩng 720nm của các ống nghiệm cĩ lượng tyrosin tương ứng từ 0.2 – 1.0M được trình bày trong bảng 3.4 (phụ lục 2)
Bảng 3.4. Mật độ quang của tyrosin ở bƣớc sĩng 720nm
Mẫu 02 03 04 05 06
Lượng tyrosin tương ứng (M) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Độ hấp thu quang OD(AU) 0.1059 0.1812 0.3138 0.3464 0.4688
Ống số 1 là ống thử khơng (TK), các ống cịn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và biến thiên độ hấp thu quang ở bước sĩng 720nm như hình 3.3 với phương trình đường chuẩn là y = 0.4454x + 0.016.
Đường chuẩn Anson
y = 0.4454x + 0.016 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Lượng Tyrosin (mM ) M ật đ ộ qu an g (A U )
Hình 3.3. Đƣờng chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ tyrosin.
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Cách tính
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều kiện chuẩn (35.5o
C, pH 7.6 …) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hịa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sĩng 660nm tương ứng với 1M Tyrosin trong đường chuẩn.
Hđ P = Tyrosin*V*L t*m*v (UI)
với
Hđ P: hoạt tính protein (UI)
V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml). v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).
t: thời gian thủy phân (phút)
m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha lỗng mẫu enzyme.
M Tyrosin: lượng M Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn.
3.6 KHẢO SÁT LƢỢNG ENZYME THU ĐƢỢC SAU CÁC GIAI ĐOẠN TINH CHẾ. TINH CHẾ.
Trong quá trình tinh chế enzyme chúng tơi tiến hành khảo sát lượng protein thu được sau mỗi phân đoạn bằng cách lấy ra 0,1g dung dịch enzyme, sau đĩ định mức thành100ml bằng nước cất để xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 với cách tính như sau:
Thế giá trị mật độ quang ∆OD ở mỗi phân đoạn vào phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry là y = 0.0007x – 0.0004 ta suy ra được nồng độ protein trong dung dịch đã pha lỗng là x. Sau đĩ, áp dụng cơng thức
m n x
M *0.001* (mg/g)
với x: là nồng độ protein trong dung dịch đã pha lỗng (mg/ml). n: hệ số pha lỗng
LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
để tính lượng protein trong nguyên liệu là M (mg/g).
Bảng 3.5. Lƣợng protein thu đƣợc ở các phân đoạn tinh chế khác nhau. 247.71 199.14 184.86 179.14 174.86 162.00 0 50 100 150 200 250 300
pH 5.7 pH 9 (NH4)2SO4 NaCl Kết tinh Tái kết tinh
Các giai đoạn tinh chế
L ư ợn g p ro te in ( mg /g )
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên lƣợng protein sau mỗi giai đoạn tinh chế.
Nhận xét:
Từ bảng số liệu và biểu đồ trên ta nhận thấy rằng, trong quá trình tinh chế enzyme bằng phương pháp tủa muối thì hàm lượng protein trong mẫu giảm dần. Điều này cĩ thể được giải thích như sau: lượng protein ban đầu cao là do trong nhựa khơ chưa tinh chế ngồi papain cịn cĩ nhiều protein khác, sau mỗi giai đoạn tinh