1.2.1 Khái niệm
Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất trong những điều kiện nhất định Các tính chất đó có thể là tính chất hấp phụ của chất rắn, tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion, sự rây phân tử theo kích thƣớc của chúng, sự tạo phức và sự liên hợp phân tử, sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau…
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phƣơng pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc biến đổi bằng liên kết hố học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) Pha tĩnh (stationnary phase) có tác dụng giữ hóa chất
Pha động (mobile phase) trong đó hóa chất hịa tan Nguyên tắc:
Hợp chất có ái lực ít với pha tĩnh thì có xu hƣớng ra khỏi cột trƣớc
Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau
1.2.2 Nguyên tắc hoạt động
Hệ thống dung mơi đóng vai trị là pha động đƣợc máy bơm cao áp hút qua bộ khử khí (Degasse) nhằm loại bỏ hết bọt khí cịn sót lại trong dung môi trƣớc khi qua máy bơm, sau đó dung mơi đƣợc trộn với nhau theo tỷ lệ đã chọn (điều khiển bằng máy tính) và đƣợc bơm liên tục qua cột tách
Mẫu phân tích đƣợc đƣa vào cột tách bằng bộ phận tiêm mẫu sau đó đƣợc pha động đẩy qua cột tách, quá trính tách chất phân tích xảy ra ở đây
Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lƣợt vào đầu dị (detector) thích hợp và đƣợc chuyển thành tín hiệu, đƣợc khuếch đại và chuyển đến bộ phận ghi, xử lý kết quả
Trong HPLC, pha tĩnh trong cột là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký
Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo.
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử
Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha động.
Nhƣ vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C... vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C... sẽ đƣợc tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tƣơng tác
Tổng của 3 tƣơng tác này sẽ quyết định chất nào đƣợc rửa giải ra khỏi cột trƣớc tiên khi lực lƣu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) và ngƣợc lại
Đối với mỗi chất, sự lƣu giữ đƣợc qui định bởi 3 lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trị quyết định, cịn F3 là yếu tố ảnh hƣởng khơng lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột.
Nhƣ vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột. Chất phân tích A + B + C Pha tĩnh Pha động F1 F3 F2
SVTH Nguyễn Minh Điện 22
1.3 Cách phân loại sắc ký trong HPLC [1,2]
Trong HPLC đƣợc chia thành hai loại chính: HPLC với pha thƣờng (Normal – phase HPLC)
Pha tĩnh nhƣ silica ( pH = 2 – 8 ), alumina ( pH = 2 – 12 ), diol, -NH2 ghép nhánh,…
Pha động: Dung mơi ít phân cực hơn nhƣ hexan, CHCl3,…
HPLC pha thƣờng còn đƣợc xem là kỹ thuật sắc ký hấp thu, đây là phƣơng pháp sử dụng một pha động không phân cực kết hợp với một pha tĩnh phân cực
HPLC với pha đảo (Reversed – Phase HPLC)
Pha tĩnh: bề mặt kỵ nƣớc tạo bởi các dây nhánh C18, C8, C4, Phenyl,… Pha động: thông dụng Metanol, Acetonitrile, nƣớc hay hỗn hợp hai hay ba dung môi trên.
Áp dụng: trên 80% trƣờng hợp sử dụng cột pha đảo trong phân tích HPLC là do: Chất phân tích đƣợc giữ trên pha tĩnh phân cực nhỏ hơn cho đến khi bị rữa trôi bởi pha động phân cực đủ lớn
Thao tác đơn giản Hiệu quả cao
Cột làm việc ổn định Có thể phân tích cho cả hai loại cấu tử có đặc tính tƣơng tự hoặc khác xa nhau.
1.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC [8,1,2]
1.4.1 Dung môi
Hệ thống HPLC thƣờng có 4 bình chứa dung mơi để rửa giải cột, cho phép sử dụng đến 4 loại dung môi cho việc rửa giải nhờ bộ phận trộn sau máy bơm Tuy nhiên thực tế thƣờng chỉ sử dụng 2 loại dung mơi để q trình pha trộn dung môi đƣợc đồng nhất và hệ pha động đơn giản giúp quá trình rửa giải ổn định
Dung mơi dùng cho HPLC có thể là nƣớc, các loại dung dịch đệm, methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp các loại trên Tất cả dung mơi phải có độ tinh khiết cao đạt tiêu chuẩn HPLC, khơng có lẫn bụi bẫn, bọt khí Trƣớc khi lắp đặt vào hệ thống, các bình dung mơi cần đƣợc khử hết bọt khí cịn lẫn trong dung mơi bằng cách đặt bình dung mơi đã mở nắp vào bồn siêu âm và cho máy siêu âm hoạt động trong 5 – 10 phút để loại bọt khí
1.4.2 Bộ khử khí (Degasse)
Trƣớc khi lắp một bình dung mơi vào vị trí hoạt động, cần phải loại bỏ phần khơng khí đã hịa tan vào dung mơi trƣớc đó gọi là khử bọt khí (degassing).
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ cịn sót lại trong dung mơi pha động
Nếu nhƣ trong q trình phân tích mà dung mơi pha động cịn sót các bọt khí thì có thể gây ra một số hiện tƣợng sau đây:
Tỷ lệ pha động của các đƣờng dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lƣu của peak thay đổi và gây ra hiện tƣợng nhiễu đƣờng nền
Trong trƣờng hợp bọt q nhiều bộ khử khí khơng thể loại trừ hết đƣợc thì có thể bơm sẽ khơng hút đƣợc dung mơi, khi đó áp suất khơng lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động
Trong bất cứ trƣờng hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai
1.4.3 Bơm (Pump)
Mục dích là bơm pha động vào cột để thực hiện quá trình sắc ký,bơm của máy HPLC là loại máy bơm cao áp dùng để duy trì một tốc độ chảy của pha động qua cột một cách liên tục, áp suất có thể đạt đến 400 bar, có thể điều chỉnh tốc độ dịng trong khoảng 0 05-10 mL/phút, bơm có thể dùng để trộn 2 đến 4 lọai dung môi khác nhau.
1.4.4 Hệ thống tiêm mẫu (injector)
Bộ phận tiêm mẫu dùng để đƣa mẫu vào cột phân tích với thể tích từ 1µl - 100µl.
Có hai cách đƣa mẫu vào cột là tiêm mẫu bằng phƣơng pháp thủ công (bằng tay) và
SVTH Nguyễn Minh Điện 24
1.4.5 Cột (Column)
Cột sắc ký chứa pha tĩnh thƣờng làm bằng thép khơng gỉ có nhiều kích thƣớc khác nhau, thơng thƣờng từ 10-30cm hạt nhồi cột đƣờng kính của hạt khác nhau (Φ =3- 10µm) tùy thuộc vào mục đích sử dụng Chất nhồi cột thơng thƣờng: C18 cịn gọi là octadecyl hoặc ODS; C8, còn gọi là octyl; trimethylsilyl, còn gọi là TMS hoặc Methyl; Phenyl Chất nhồi thƣờng có hai dạng là dạng hình cầu và dạng vơ định hình, kích thƣớc thƣờng ở 3 cỡ là 3μm, 5μm và 10μm Hạt càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt nhƣng chậm ra peak và làm tăng áp lực bơm pha động
Với HPLC thƣờng dùng cột 150 x 4 6mm, 5m và 250 x 4.6, 5m.
1.4.6 Đầu dò (Detector) [8]
Đầu dò là bộ phận theo dõi và phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột một cách liên tục
Nó là một bộ phận thu nhận và phát hiện các chất hay hợp chất phân tích dựa theo một tính chất hố học hay hố lý hay tính chất vật lý nào đó của chất phân tích Tùy theo tính chất của chất phân tích mà ngƣời ta lựa chọn đầu dị thích hợp và phải thỏa mãn điều kiện trong cùng một nồng độ nhất định của chất phân tích
A = k.C
Trong đó: A – Tín hiệu thu đƣợc C – Nồng độ chất phân tích
k – Hằng số thực nghiệm của đầu dị đã chọn Tín hiệu này có thể là độ hấp thu, cƣờng độ phát xạ, cƣờng độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất…)
Trên cơ sở đó ngƣời ta chế tạo ra các loại đầu dị sau: - Đầu dò quang phổ tử ngoại (UV )
- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS ): đây là loại thông dụng nhất hiện nay dùng để phát hiện các chất hấp thụ quang.
- Đầu dò huỳnh quang: để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên cũng nhƣ các dẫn xuất có huỳnh quang các hydrocacbon thơm đa
vòng (Polyaromatic hydrocarbon), các aminoacide, các Peptide,
Vitamincatecholamines, Aflatoxine, ngồi ra ngƣời ta cịn dùng kỹ thuật tạo
- Đầu dò Diod Array (PDA/DAD photodiode Array/Diod Array Detector): là loại đầu dò mạnh nhất trong các loại đầu dò để đo phổ tử ngoại vì các số liệu quang phổ cho mỗi peak sắc ký đƣợc ghi nhận và lƣu lại ở một dãy phổ Giúp ích cho việc xác định bƣớc sóng tối ƣu của các chất
Ngồi ra, trong HPLC còn sử dụng một số đầu do khác nhƣ đầu dò chỉ số khúc xạ (Refractive index detector, RI detector), đầu dò đo độ dẫn điện (Conductivity detector), đầu dò amper kế (Amperometric detector), đầu dò LC – MS…
1.4.7 Hệ dữ liệu (Data system)
Thông thƣờng ngƣời ta dùng máy tự ghi (recorder) để ghi sắc đồ của sự tách, hay có thể dùng máy in (printer), bộ tích phân kế (intergrator), máy vi tính…
2 Phân tích định tính [8]
Có nhiều phƣơng pháp định tính Thiamphenicol và Enrofloxacin nhƣ phƣơng pháp hóa học, phƣơng pháp HPLC (dựa vào thời gian lƣu của chúng trong cột sắc ký), phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (Think Layer Chromatography - TLC) Ở nội dung đề tài này chỉ giới thiệu phƣơng pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng dựa chủ yếu vào hiện tƣợng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất háp thu trơ nhƣ silica gel hoặc oxid alumin Pha tĩnh này đƣợc trang thành một lớp mỏng đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấp kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic
Hình 3.2 Bình sắc ký lớp mỏng
Bình sắc ký bằng thủy tinh có nắp đậy
Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0 25mm của một loại chất hấp thu nhƣ silica gel, alumin,… đƣợc tráng thành một lớp mỏng đều phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm
Pha động (dung môi) Tấm nền mỏng Bình sắc ký Nắp đậy Pha tĩnh (chất hấp thu) Mẫu cần phân tích
SVTH Nguyễn Minh Điện 26 kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ
Mẫu cần phân tích: thƣờng là hỗn hợp nhiều chất có độ phân cực khác nhau, sử dụng vi quản chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở phía trên cao hơn một chút so với mặt thống của chất lỏng (pha động) đang chứa trong bình sắc ký
Pha động: một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển dọc theo tấm lớp mỏng và lơi kéo mẫu chất đi theo nó Dung mơi di chuyển nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tƣơng tác tĩnh điện giữa pha tĩnh và các thành phần của mẫu chất (hiện tƣợng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ tan của mẫu chất trong dung môi
Phƣơng pháp tiến hành
Dùng ống mao quản chấm lần lƣợt các điểm của dung dịch chuẩn đối chứng và dung dịch mẫu cần phân tích lên bản sắc ký Với mỗi điểm, chấm nhiều lần nhƣng giữ cho vết chấm không lan rộng Sau khi chấm hồn tất, tiến hành làm khơ để dung môi bay đi khỏi vết chấm rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly, đậy nắp bình sắc ký lại
Khi dung mơi di chuyển lên tới mức tiền tuyến thì lấy bản sắc ký ra khỏi bình giải ly, sau đó làm khơ bản rồi tiến hành quan sát các vết của mẫu dƣới đèn tia tử ngoại (UV) Đo vị trí các vết và vị trí mực dung mơi di chuyển đƣợc rồi tính giá trị Rf của
từng vết So sánh Rf của vết bên dung dịch chuẩn và vết bên dung dịch mẫu để xác
định xem trong mẫu có chứa chất cần phân tích hay khơng
Hình 3.3 Mơ hình chấm sắc ký
Đoạn đƣờng di chuyển của chất phân tích Đoạn đƣờng di chuyển của pha động Rf = =
a b
Tiền tuyến dung môi
Mức xuất phát a
Ƣu điểm của sắc ký lớp mỏng: chỉ cần một lƣợng rất ít mẫu để phân tích, có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể đƣợc định vị trên tấm sắc lớp mỏng
3 Phân tích định lƣợng [1,2,9]
3.1 Dựng đƣờng chuẩn [9]
Đƣờng chuẩn thể hiện cho tính tuyến tính của quy trình phân tích Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phƣơng pháp dựa vào đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng (response) của đại lƣợng đo đƣợc (y) và nồng độ (concentration) là một một đƣờng thẳng (x)
y = ax + b
Đại lƣợng đặc trƣng cho tính tuyến tính là hệ số tƣơng quan R (coefficient of
correlation) Thƣờng chấp nhận sự tuyến tính khi 0 95 ≤ R2 ≤ 1
3.2 Hiệu suất thu hồi
Hiệu suất thu hồi là % hàm lƣợng chất phân tích đo đƣợc sau một hay nhiều giai đoạn thực hiện của phƣơng pháp phân tích so với hàm lƣợng chất phân tích thực ban đầu
Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 80 – 100%, quy trình lý tƣởng thì hiệu suất đạt 95% Đối với các mẫu phức tạp hiệu suất thu hồi có thể đạt từ 70 – 75%.
Cách đo hiệu suất thu hồi bằng phƣơng pháp thêm chuẩn:
Mẫu trắng khơng chứa chất phân tích có nền mẫu giống nhƣ mẫu muốn đo
Mẫu phân tích có chứa chất phân tích: tiến hành quy trình phân tích để xác định
lƣợng chất phân tích ban đầu có trong mẫu ký hiệu CM
Thêm vào một lƣợng chất phân tích có nồng độ xác định (CC) vào mẫu cần phân tích, thực hiện quy trình phân tích để xác định lƣợng chất phân tích (CMC) đã thêm vào mẫu và tính hiệu suất thu hồi theo cơng thức:
Trong đó: CB – nồng độ chất phân tích có trong mẫu trắng (bị nhiễm mẫu)
CM – nồng độ chất tích có trong mẫu phân tích
CC – nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích
CMC – nồng độ chất tích có trong mẫu phân tích đã đƣợc thêm chuẩn
CMC – CM – CB CC
SVTH Nguyễn Minh Điện 28
3.3 Xác định RSD, LOD, LOQ [9]
RSD ( Relactive Standard Deviation): Độ lệch chuẩn tƣơng đối (%) là đại lƣợng đặc trƣng cho độ chính xác của phƣơng pháp phân tích, cho biết mức độ phân tán của các phép thử song song khi áp dụng phƣơng pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định
LOD (limit of detection) là cực tiểu phát hiện đƣợc của phƣơng pháp phân tích, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu nhất định mà thiết bị có thể phát hiện đƣợc
LOQ (limit of quantitation) là cực tiểu đo đƣợc của phƣơng pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng đƣợc với một RSD% quy định
Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn, trong quá trình xây dựng dƣờng chuẩn, ứng với từng nồng độ pha chuẩn Ci ta đo đƣợc diện tích peak tƣơng ứng Si.
Xác định hệ số hiệu chỉnh tuyến tính theo cơng thức: ΔCSi= Si
Ci
Xác định hệ số hiệu chỉnh tuyến tính trung bình
i C S + + C S + C S = i i ...