Khảo sát sự thay đổi hàm lƣợng Enrofloxacin và Thiamphenicol còn lại trong huyết tƣơng heo theo thời gian
3.3.2 Phương pháp tiến hành khảo sát
3.3.2.1 Khảo sát hàm lượng của Thiamphenicol
Đối tƣợng khảo sát: Heo có thể trọng khoảng 35kg
Số lƣợng khảo sát: 06 con, trong đó 03 con đƣợc khảo sát với thuốc do công ty Vemedim sản xuất, 03 con còn lại khảo sát với thuốc do công ty khác sản xuất Thuốc dùng khảo sát:
Thuốc của công ty Vemedim sản xuất: VIMEXYSON COD (10gThiamphenicol/100 mL dung dịch)
Thuốc của công ty khác sản xuất (10g Thiamphenicol/100 mL dung dịch). Liều lƣợng tiêm: 7 mL/con
Thời gian tiêm: 8h10, ngày 01/3/2011
Địa điểm tiến hành: Trại thử nghiệm, công ty Vemedim, quận Ơ Mơn, thành phố Cần Thơ
Thời gian lấy mẫu: sau khi tiêm thuốc 1 giờ, 6 giờ, 24 giờ và 48 giờ tiến hành lấy mẫu máu về phân tích
Mẫu máu sau khi lấy từ heo thử nghiệm đƣợc thêm vào 0 5% sodium EDTA nhằm giữ cho máu không bị đông lại Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút Tách lấy huyết tƣơng bảo quản ở nhiệt độ – 20oC đến khi phân tích
Tiến hành phân tích hàm lƣợng của Thiamphenicol trong huyết tƣơng thu đƣợc bằng phƣơng pháp chiết SPE và phân tích HPLC theo quy trình đã xây dựng ở trên Sau đó xác định hàm lƣợng Thiamphenicol còn lại trong huyết tƣơng theo công thức:
Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 38249x + 818.66
Ta có nồng độ cịn lại của Thiamphenicol trong mẫu khảo sát:
CThiam HT= y−818 . 66
38249 ×V2
V1×H× HSPL
Trong đó CThiam HT – là nồng độ Thiamphenicol có trong huyết tƣơng
H: là hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích đã xây dựng H% = 96.25%
HSPL – là hệ số pha loãng y là diện tích peak đo đƣợc
V1 – là thể tích huyết tƣơng ban đầu V2 – là thể tích định mức.
Kết quả khảo sát đƣợc trình bày qua biễu bảng và đồ thị nhƣ sau:
Bảng 4.7 Kết quả phân tích hàm lƣợng Thiamphenicol trung bình trong huyết tƣơng với thuốc Vemexyson COD của Công ty Vemedim.
Đại lƣợng Thời gian
V(mL)
Huyết tƣơng Diện tích peak
C (ppm) thu hồi 1h sau tiêm 4.5 262425 6.2700 6h sau tiêm 5 514971 2.7932 24h sau tiêm 5.6 18343 0.0850 48h sau tiêm 5.7 15461 0.0698
SVTH Nguyễn Minh Điện 50
Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lƣợng Thiamphenicol trung bình trong huyết tƣơng với thuốc của Công ty khác.
Đại lƣợng Thời gian
V(mL)
Huyết tƣơng Diện tích peak
C (ppm) thu hồi 1h sau tiêm 6 444216 8.0742 6h sau tiêm 6.8 259091 1.0317 24h sau tiêm 6.6 54273 0.2200 48h sau tiêm 6.8 38063 0.1488
Biếu diễn kết quả tính tốn trên đồ thị về hàm lƣợng cịn lại của Enrofloxacin theo thời gian
Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ Thiamphenicol trong huyết tƣơng theo thời gian.
Nhận xét – đánh giá
Từ bảng kết quả và đồ thị trên cho ta thấy, Thiamphenicol hấp thu nhanh qua đƣờng tiêm, nồng độ thuốc đạt mức cao trong thời gian 1 giờ đầu sau tiêm, và sau đó nồng độ Thiamphenicol trong máu giảm rất nhanh
Khoảng thời gian từ sau 48 giờ sau tiêm thì nồng đồ Enrofloxacin vẫn cịn tồn tại trong máu ở mức thấp Đối với thực nghiệm với thuốc Vemexyson COD thì nồng độ Thiamphenicol còn lại gần bằng giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp, LOQ = 0.0762) Còn đối với thực nghiệm với thuốc của cơng ty khác sản xuất thì nồng độ Thiamphenicol còn lại ở 48 giờ sau tiêm vẫn còn cao hơn (0 0698 ppm đối với thuốc Vemexyson COD và 0 1488 ppm đối với thuốc của công ty khác).
Giới hạn dƣ lƣợng tối đa cho phép (MRL, Maximum Residue Limits) của
Thiamphenicol là 50 µg/kg thể trọng, tƣơng ứng với 0 05 mg/kg thể trọng [TL24]
So sánh giữa thuốc của công ty Vemedim (Vemexyson COD) và công ty khác cho kết quả nhƣ sau: thời gian sau tiêm thuốc đƣợc 1 giờ thì nồng độ Thiamphenicol trong máu của vật nuôi thử nghiệm trong thực nghiệm dùng thuốc của công ty khác cao hơn trong thực nghiệm dùng thuốc Vemexyson COD.
Trong giai đoạn đầu khảo sát (từ 1 giờ - 6 giờ): nồng độ Thiamphenicol trong máu giảm rất nhanh, trong đó ở giai đoạn này thì nồng độ Thiamphenicol trong máu khi sử dụng thuốc của công ty khác giảm nhanh hơn so với khi sử dụng thuốc Vemexyson COD (Vemexyson COD giảm 2.3 lần, thuốc của công ty khác giảm 7 6 lần)
Song giai đoạn từ 6 giờ đến 24 giờ, nồng độ Thiamphenicol trong máu khi sử dụng thuốc của công ty khác giảm chậm lại hơn so với khi sử dụng thuốc Vemexyson COD (Vemexyson COD giảm 32.8 lần, Thuốc của công ty khác giảm 4.7 lần) Giai đoạn từ 24 giờ đến 48 giờ, tốc độ giảm nồng độ Thiamphenicol trong máu đối với hai loại thuốc là gần nhƣ nhau (Vemexyson COD giảm 1 2 lần, thuốc của công ty khác giảm 1 5 lần)
Nhƣ vậy, từ đồ thị cho ta rút ra kết luận, khi sử dụng thuốc Vemexyson COD có tác dụng kéo dài hơn so với khi sử dụng thuốc do công ty khác sản xuất
3.3.2.2 Khảo sát hàm lượng của Enrofloxacin
Đối tƣợng khảo sát: Heo có thể trọng khoảng 40kg
Số lƣợng khảo sát: 04 con, trong đó 03 con đƣợc khảo sát với thuốc do công ty Vemedim sản xuất, 03 con còn lại khảo sát với thuốc do công ty khác sản xuất Thuốc dùng khảo sát:
Thuốc của công ty Vemedim sản xuất: Vemetryl 5 (5g Enrofloxacin/100 mL dung dịch)
Thuốc của công ty khác sản xuất (5g Enrofloxacin/100 mL dung dịch) Liều lƣợng tiêm: 4 mL/con.
Thời gian tiêm: 8h15, ngày 15/02/2011
Địa điểm tiến hành: Trại thử nghiệm, cơng ty Vemedim, quận Ơ Mơn, thành phố Cần Thơ
Thời gian lấy mẫu: sau khi tiêm thuốc 1 giờ, 6 giờ, 24 giờ và 48 giờ tiến hành lấy mẫu máu về phân tích
SVTH Nguyễn Minh Điện 52 Mẫu máu sau khi lấy từ heo thử nghiệm đƣợc thêm vào 0 5% sodium EDTA nhằm giữ cho máu không bị đơng lại Ly tâm với tốc độ 6000 vịng/phút Tách lấy huyết tƣơng bảo quản ở nhiệt độ – 20oC đến khi phân tích
Tiến hành phân tích hàm lƣợng của Enrofloxacin trong huyết tƣơng thu đƣợc bằng phƣơng pháp chiết SPE và phân tích HPLC theo quy trình đã xây dựng ở trên Sau đó xác định hàm lƣợng Enrofloxacin cịn lại trong huyết tƣơng theo cơng thức: Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 60315x + 438
Ta có nồng độ cịn lại của Enrofloxacin trong mẫu khảo sát:
HSPL H V V y = C 1 2 HT Enro 60315 438
Trong đó CEnro HT – là nồng độ Enrofloxacin có trong huyết tƣơng
H% - là hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích đã xây dựng H% = 82.81%
HSPL – là hệ số pha loãng mẫu y – là diện tích peak đo đƣợc
V1 – là thể tích huyết tƣơng ban đầu
V2 – là thể tích cuối của q trình phân tích V2 = 1 mL Kết quả khảo sát đƣợc trình bày qua biễu bảng và đồ thị nhƣ sau:
Bảng 4.9 Kết quả phân tích hàm lƣợng Enrofloxacin trung bình trong huyết tƣơng với thuốc Vemetryl 5 của Công ty Vemedim.
Đại lƣợng Thời gian
V(mL)
Huyết tƣơng Diện tích peak
C (ppm) thu hồi 1h sau tiêm 3.25 269820 1.6595 6h sau tiêm 5 288746 1.1545 24h sau tiêm 3.75 82080.5 0.4359 48h sau tiêm 5 34788 0.1375
Bảng 4.10 Kết quả phân tích hàm lƣợng Enrofloxacin trung bình trong huyết tƣơng với thuốc của Công ty khác.
Đại lƣợng Thời gian
V(mL)
Huyết tƣơng Diện tích peak
C (ppm) thu hồi 1h sau tiêm 5 209116.5 0.8356 6h sau tiêm 4.5 159533 0.7078 24h sau tiêm 4.75 40236.5 0.1678 48h sau tiêm 5 25596 0.1007
Biếu diễn kết quả tính tốn trên đồ thị về hàm lƣợng còn lại của Enrofloxacin theo thời gian 0 0.4 0.8 1.2 1.6 0 10 20 30 40 50 Thời gian (h) N ồn g độ ( pp m )
Thuốc của cơng ty Vemedim
Thuốc của cơng ty khác
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ Enrofloxacin còn lại trong huyết tƣơng theo thời gian.
Nhận xét – đánh giá
Từ bảng kết quả và đồ thị trên cho ta thấy, Enrofloxacin hấp thu nhanh qua đƣờng tiêm, nồng độ thuốc đạt mức cao trong thời gian 1 giờ đầu sau tiêm và vẫn duy trì nồng độ có hiệu lực trong 24 giờ sau tiêm
Nồng độ Enrofloxacin giảm đi một nữa trong khoảng thời gian từ 14 – 16 giờ sau tiêm Do điều kiện khảo sát và thời gian không cho phép nên không thể tiến hành khảo sát chính xác thời gian bán phân hủy của thuốc Dựa vào đồ thị ta thấy, thời gian bán phân hủy của hai loại thuốc gần bằng nhau
SVTH Nguyễn Minh Điện 54 Khoảng thời gian từ sau 48 giờ sau tiêm thì nồng độ Enrofloxacin vẫn cịn tồn tại trong máu ở mức thấp, C = 0.1007 ppm (gần bằng giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp, LOQ = 0 0752), điều này cho phép kết thúc quá trình khảo sát vì q trình phân tích sau thời gian này chỉ mang tính chất định tính nhằm xem xét sự tồn tại của Enrofloxacin trong máu vật nuôi
Giới hạn dƣ lƣợng tối đa cho phép (MRL, Maximum Residue Limits) của
Enrofloxacin là 100 µg/kg thể trọng, tƣơng ứng với 0 1 mg/kg thể trọng [TL24]
So sánh giữa thuốc của công ty Vemedim (Vemetryl 5) và thuốc của công ty khác sản xuất cho kết quả nhƣ sau: thời gian sau tiêm thuốc đƣợc 1 giờ thì nồng độ Enrofloxacin trong máu của vật nuôi thử nghiệm trong thực nghiệm dùng thuốc của công ty khác sản xuất thấp hơn trong thực nghiệm dùng thuốc Vemetryl 5
Trong giai đoạn đầu khảo sát (từ 1 giờ - 6 giờ): nồng độ Enrofloxacin trong máu giảm nhƣ nhau đối với hai loại thuốc sử dụng (Vemetryl 5 giảm 1 4 lần, thuốc của công ty khác giảm 1 2 lần) Giai đoạn từ 24 giờ đến 48 giờ, nồng độ Enrofloxacin trong máu vật nuôi thử nghiệm khi sử dung thuốc của công ty khác giảm nhanh hơn so với sử dụng thuốc Vemetril 5 (Vemetryl 5 giảm 3 1 lần, thuốc của công ty khác giảm 4 1 lần) Song giai đoạn cuối khảo sát thì nồng độ Enrofloxacin trong máu đối với thử nghiệm thuốc Vemetryl 5 đã nhanh hơn Kết quả tại thời gian khảo sát 48 giờ sau tiêm thuốc thì nồng độ Enrofloxacin cịn lại trong máu trong cả hai trƣờng hợp thuốc thử ngiệm là gần nhƣ nhau
PHẦN 3
56
CHƢƠNG V
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
1 Kết luận
Qua quá trình lựa chọn các quy trình phân tích đã đƣợc tiến hành trƣớc đó và thực nghiệm lại các quy trình này trong điều kiện của phịng thí nghiệm cho ta rút ra kết luận nhƣ sau: q trình phân tích bằng kỹ thuật chiết tách SPE thu đƣợc hiệu suất chiết tách cao hơn so với quá trình chiết tách theo kỹ thuật chiết lỏng lỏng Đồng thời, kỹ thuật chiết SPE dễ thực hiện, dễ tự động hóa và tiết kiệm dung mơi hơn so với kỹ thuật chiết lỏng lỏng Trong kỹ thuật phân tích hiện đại thì kỹ thuật chiết SPE đƣợc lựa chọn sử dụng rộng rãi hơn so với các kỹ thuật chiết tách khác
Trong kỹ thuật chiết SPE, vấn đề quyết định hiệu suất của sự chiết tách là pha rắn trong cột chiết, khả năng chiết tách phụ thuộc rất nhiều vào loại chất nhồi, bản chất và kích thƣớc của chất nhồi trong cột chiết Đồng thời việc lựa chọn dung mơi thích hợp cũng là một trong những yếu tố có ảnh hƣởng trực tiếp đến hiệu suất của quá trình chiết tách
Kỹ thuật HPLC hiện đang đƣợc sử dụng rất rộng rãi trong các ngành phân tích hiện đại Cũng nhƣ kỹ thuật chiết SPE thì loại cột HPLC là yếu tố quyết định của cả quy tình phân tích Tùy thuộc vào bản chất của q trình phân tích mà có sự lựa chọn loại cột HPLC cho phù hợp Song song đó, cũng khơng thể bỏ qua sự ảnh hƣởng của dung mơi đối với q trình phân tích Trong HPLC thì dung mơi phải là loại dung mơi đƣợc sản xuất dành riêng cho HPLC
Với các điều kiện làm việc tại phịng thí nghiệm, quy trình chiết tách SPE và phân tích HPLC thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Quy trình phân tích Thiamphenicol
Sử dụng cột SPE StrataTM
– X 33µm, polymeric Sorbent.
Máy HPLC Shimazdu LC – 20AD với đầu dò UV, cột RP – C18 Gemini Phenomenex 150 x 4 6 mm, 5µm Pha động: Acetonitrile: nƣớc cất (tỷ lệ 1:1) Tốc độ dòng 1 mL/phút Detecter UV 225nm
Quy trình có độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD = 0 7569%, giới hạn phát hiện LOD = 0 0254 ppm, giới hạn định lƣợng LOQ = 0 0762 ppm, hiệu suất thu hồi %H = 96 25%
Quy trình phân tích Enrofloxacin
Sử dụng cột SPE StrataTM
Máy HPLC Shimazdu LC – 20AD với đầu dò UV, cột RP – C18 Gemini Phenomenex 150 x 4.6 mm, 5µm. Pha động: Đệm KH2PO4 0.05 M pH = 2 điều chỉnh bằng H3PO4. A – Đệm KH2PO4 : Acetonitrile (tỉ lệ 80 : 20) B – Acetonitrile Tỷ lệ A : B = 50 : 50 Tốc độ dòng 1 mL/phút Detecter UV 290nm
Quy trình có độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD = 0 6872%, giới hạn phát hiện LOD = 0 0251 ppm, giới hạn định lƣợng LOQ = 0 0752 ppm, hiệu suất thu hồi %H = 81 82%
Sử dụng quy trình phân tích trên tiến hành khảo sát thực nghiệm thu đƣợc kết quả: với 4 loại thuốc đem tiến hành khảo sát thì nồng độ thuốc đạt mức cao trong máu trong khoảng thời gian 1 giờ đầu sau tiêm Sau đó nồng độ thuốc giảm nhanh theo thòi gian Sau 48 giờ tiêm thuốc, nồng độ thuốc vẫn còn tồn tại trong máu nên cần chú ý xem xét thời gian ngƣng sử dụng thuốc trƣớc khi tiến hành giết mổ
2 Kiến nghị
Cần tiến hành khảo sát thêm các yếu tố ảnh hƣởng đến quy trình phân tích nhƣ nhiệt độ, áp suất, tốc độ dòng pha động, loại cột HPLC, để xây dựng đƣợc quy trình phân tích tối ƣu hơn, hiệu suất thu hồi cao hơn
Mở rộng khảo sát thêm nhiều đối tƣợng khác nhƣ gà, vịt, trâu, bò, nhằm phân tích đƣợc sự phản ứng khác nhau của các vật nuôi đối với thuốc, đánh giá đƣợc khả năng hấp thu, chuyển hóa của thuốc ở từng vật nuôi khác nhau mà có bƣớc điều chỉnh lƣợng thuốc sử dụng cho phù hợp
Cần tiến hành khảo sát những khoảng thời gian gần nhau hơn và kéo dài thời gian khảo sát nhƣ khảo sát các khoảng thời gian 1 giờ, 2 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 72 giờ để có kết quả chính xác về thời gian đạt nồng độ cực đại của thuốc và thời gian bán hủy của thuốc trong cơ thể vật ni, đánh giá đƣợc chính xác hơn tốc độ biến thiên của nồng độ thuốc trong máu vật ni thử nghiệm Đồng thời có thêm kết quả về thời gian hết hẳn của thuốc trong máu vật ni mà có khuyến cáo sử dụng thuốc hợp lý hơn
58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chu Phạm Ngọc Sơn Kỹ thuật sắc ký lỏng, Tháng 10/2010, Trung tâm
phát triển và đào tạo sắc ký Thành phố Hồ Chí Minh
2. Phạm Thị Ánh Phân tích bằng kỹ thuật sắc ký, 2010, Trung tâm đào tạo
và phát triển sắc ký Thành phố Hồ Chí Minh
3. Hồ Viết Quý Cơ sở hóa học phân tích hiện đại, tập 3 Các phương pháp
phân chia, làm giàu và ứng dụng phân tích, 2002, NXB Đại học Sƣ phạm
4. Nguyễn Đức Huệ Các phương pháp phân tích hữu cơ, 2005, NXB Đại
học Quốc Gia Hà Nội
5. Bùi Thị Tho BSTY Nghiêm Thị Anh Đào Giáo trình dược lý thú y, 2005,
NXB Hà Nội
6. Britsh pharmacopoeic 2007.
7. Võ Văn Ninh Kháng sinh trong thú y, 2001, NXB Trẻ
8. Nguyễn Thị Phi Phụng Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, 2007, NXB
Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh.
9. Bộ mơn hóa phân tích – kiểm nghiệm – độc chất Giáo trình kiểm nghiệm,
2009, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ
10. Nguyễn Phƣớc Tƣơng, Trần Diễm Uyên Sử dụng thuốc và biệt dược thú
y, 2000, NXB Nông nghiệp
11. Bùi Thị Tho Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong chăn nuôi,
2003, NXB Hà Nội
12. Nguyễn Đình Lâm Chuyên đề Sắc ký (Cơ sở lý thuyết và ứng dụng),
Trƣờng Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng
13. Trần Bích Lam Thí nghiệm phân tích thực phẩm, 2006, NXB Đại học
Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh
14. Limian Zhao, Carol Haney Ball Determination of Chloramphenicol,
Florfenicol, and Thiamphenicol in Honey Using Agilent SampliQ OPT Solid-Phase Extraction Cartridges and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry, 2010, 1–5.
15. EH Abdennebi, CM Stowe Pharmacokinetics and distribution of thiamphenicol in sheep given repeated intramuscular doses, 1994, 5,