Lấy huyết tƣơng đã trích từ máu của heo cho rã đơng ở nhiệt phòng, chuẩn bị mẫu thử nhƣ sau: chuẩn bị 7 mẫu, mẫu T (mẫu trắng) chứa 3 mL huyết tƣơng, các mẫu còn lại mỗi mẫu chứa 2 mL huyết tƣơng và 1 mL chuẩn 20ppm đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 6 Q trình phân tích đƣợc tiến hành theo quy trình sau nhằm phân tích hàm lƣợng của Thiamphenicol đã thêm vào huyết tƣơng và đựa vào hàm lƣợng đã thêm vào để xác định hiệu suất thu hồi mà quy trình đã thực hiện đƣợc
Hình 4.5 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phƣơng pháp chiết tách SPE
Cột SPE
Rửa cột với 5 – 10mL nƣớc Rửa tiếp với 5mL n-hexan
Hòa tan với 1mL pha động
Lọc 0 45μm, phân tích HPLC Làm khơ cột 15 phút
Rửa giải với 10 – 15mL ACN
Thu dịch rửa giải, cơ quay Hoạt hóa lần lƣợt bằng:
5 – 10mL Methanol 5 – 10mL nƣớc cất
SVTH Nguyễn Minh Điện 40
Mơ tả quy trình: Cột SPE StrataTM – X 33µm, polymeric Sorbent đƣợc lần lƣợt hoạt
hóa bằng 5 – 10 mL methanol và 5 – 10 mL nƣớc cất, sau đó cho dịch chiết đã chuẩn bị nhƣ trên chảy qua cột tự nhiên với tốc độ không quá 1 mL/phút Sau khi mẫu chảy hết qua cột tiến hành rửa cột bằng 5 -10 mL nƣớc cất và 5 mL n-hexan nhằm loại bỏ hết tạp chất và mỡ ra khỏi cột
Quá trình rửa cột kết thúc, tiến hành làm khô cột từ từ bằng bơm hút chân không trong thời gian từ 10 – 15 phút Sau đó tiến hành rửa giải Thiamphenicol đã đƣợc giữ lại trên cột bằng 10 – 15 mL Acetonitrile, thu lấy dung dịch rửa giải cho vào
bình cầu, cơ quay chân khơng cho đến khi cạn ở nhiệt độ 50oC.
Sau khi cơ quay xong hịa tan mẫu bằng 1 mL pha động Siêu âm và lọc qua đầu lọc 0.45µm rồi cho vào lọ chứa mẫu 2 mL đem phân tích bằng HPLC
Phân tích mẫu trên HPLC
Máy HPLC Shimazdu LC – 20AD với đầu dò UV Pha động: Acetonitrile: nƣớc cất tỷ lệ 1:1
Tốc độ dòng 1 mL/phút Detecter UV 225nm
Cột: RP – C18 Gemini Phenomenex 150 x 4.6 mm, 5µm. Kết quả phân tích
Bảng 4.3 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Thiamphenicol trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết SPE
Mẫu T Mẫu PT
Huyết tƣơng (mL) 3 2
Chuẩn 20ppm (mL) 0 1
Diện tích peak 0 737134
Nồng độ thu hồi (ppm) ------ 19.2506
Đánh giá quy trình
Quy trình đạt hiệu suất thu hồi cao, giá trị trung bình đạt 96 25% và kết quả ổn định hơn so với quy trình chiết tách lỏng – lỏng, sự sai lệch qua các lần thực hiện chênh lệnh với nhau thấp, có thể xử dụng quy trình trên để tiến hành phân tích dƣ lƣợng Thiamphenicol trong huyết tƣơng heo.
3.2.3.2 Lựa chọn quy trình phân tích Enrofloxacin [17,18,19,20,21,22]