3.1 Định tính Thiamphenicol và Enrofloxacin bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng. mỏng.
3.1.1 Định tính Thiamphenicol
Chuẩn bị bản mỏng:
Bản sắc ký sử dụng thuộc loại bản mỏng có chất hấp thu là Silicagel 60 F254 đƣợc
cắt thành miếng nhỏ theo kích thƣớc 10 x 4 cm Dùng bút chì vạch nhẹ các nét mức xuất phát và mức tiền tuyến của dung mơi
Hình 4.1 Chuẩn bị bản mỏng định tính
Chuẩn bị dung dịch chuẩn đối chiếu và dung dịch mẫu
Dung dịch chuẩn Thiamphenicol: cân 10 mg Thiamphenicol cho vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng Acetonitrile.
Dung dịch mẫu: lấy mẫu huyết tƣơng sau khi tiêm thuốc Chuẩn bị pha động
Pha động của Thiamphenicol là hệ dung môi CH3CN : CH3OH theo tỷ lệ 97:3 Hệ
dung mơi đƣợc cho vào bình chạy bản mỏng, mực dung môi thấp hơn 1 cm, đậy kính cho cốc bảo hịa hơi dung mơi
10cm
4cm 1cm
0.5cm
Mức xuất phát Tiền tuyến dung mơi
Tiến hành chấm sắc ký và bố trí thí nghiệm nhƣ hình vẽ
Hình 4.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Kết quả định tính Thiamphenicol bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng Khoảng di chuyển của dung môi là b = 6.9 cm
Khoảng di chuyển của vết (Thiamphenicol) là a Đối với dung dịch chuẩn: a = 6 0 cm
Đối với dung dịch mẫu cần phân tích: a = 5 95 cm Giá trị Rf của các mẫu nhƣ sau:
Đối với dung dịch chuẩn: 0.8696
6.9 6 = = b a = Rf
Đối với dung dịch mẫu: 0.8623
6.9 5.95 = = b a = Rf
So sánh giá trị Rf của dung dịch chuẩn và mẫu phân tích cho ta hai giá trị sai lệch
với nhau nhỏ ∆Rf = 0.84% Điều này chứng tỏ trong mẫu phân tích có chứa Thiamphenicol.
3.1.2 Định tính Enrofloxacin
Tiến hành thí nghiệm tƣơng tự nhƣ thiamphenicol nhƣng thay đổi pha động. Chuẩn bị dung dịch chuẩn đối chiếu và dung dịch mẫu
Dung dịch chuẩn Enrofloxacin: cân 10 mg Enrofloxacin cho vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng Methanol
Dung dịch mẫu phân tích: Lấy dung dịch chuẩn ở trên thêm vào 1 mL huyết tƣơng để thu dung dịch mẫu phân tích
Điểm mẫu Mực dung môi Điểm chuẩn
SVTH Nguyễn Minh Điện 34 Pha động của Enrofloxacin là hệ dung môi CH3CN : H2O : CH3OH : CH2Cl2 theo tỷ lệ 10:20:40:40
Kết quả định tính Enrofloxacin bằng phƣơng pháp sắc ký bản mỏng Khoảng di chuyển của dung môi là b = 6.83
Khoảng di chuyển của vết (Enrofloxacin) là a Đối với dung dịch chuẩn: a = 3 cm
Đối với dung dịch mẫu cần phân tích: a = 3 cm Giá trị Rf của các mẫu nhƣ sau:
Đối với dung dịch chuẩn: 0.4392
6.83 3 = = b a = Rf
Đối với dung dịch mẫu: 0.4392
6.83 3 = = b a = Rf
So sánh giá trị Rf của dung dịch chuẩn và mẫu phân tích cho ta hai giá trị sai lệch
với nhau nhỏ ∆Rf = 0 Điều này chứng tỏ trong mẫu phân tích có chứa
Enrofloxacin.
3.2 Lựa chọn quy trình phân tích Enrofloxacin và Thiamphenicol bằng phƣơng pháp HPLC. phƣơng pháp HPLC.
3.2.1 Mục đích
Lựa chọn quy trình phân tích Enrofloxacin và Thiamphenicol trong huyết tƣơng nhằm tìm ra quy trình phân tích có hệ số thu hồi cao để tiến hành khảo sát hàm lƣợng của chúng còn lại trong huyết tƣơng heo.
3.2.2 Phương pháp tiến hành
Pha chuẩn Enrofloxacin và chuẩn Thiamphenicol theo các nồng độ nhƣ 1ppm, 2ppm, 5ppm, 10ppm và 20ppm Xây dựng đƣờng chuẩn của Enrofloxacin và Thiamphenicol thể hiện sự thay đổi của diện tích peak đo đƣợc theo nồng độ chuẩn đã pha
Phƣơng pháp pha chuẩn Chuẩn Thiamphenicol:
Chuẩn Thiamphenicol gốc 1000ppm (1000mg/L): lấy 10 mg Thiamphenicol pha thành 10 mL bằng dung dịch Acetonitrile và nƣớc theo tỷ lệ 1:1 về thể tích
Chuẩn Thiamphenicol 100ppm (100mg/L): lấy 5 mL chuẩn Thiamphenicol 1000ppm đã pha trƣớc cho vào bình định mức 50 mL, định mức đến vạch bằng nƣớc cất thu đƣợc chuẩn Thiamphenicol 100ppm
Dựng đƣờng chuẩn Thiamphenicol 1ppm, 2 5ppm, 5ppm, 10ppm, 20ppm đƣợc pha từ chuẩn 100ppm: lần lƣợt lấy 0 1 mL, 0 25 mL, 0 5 mL, 1 mL và 2 mL chuẩn Thiamphenicol 100ppm cho vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng nƣớc cất thu đƣợc dãy đƣờng chuẩn của Thiamphenicol từ 1ppm đến 20ppm
Chuẩn Enrofloxacin cũng đƣợc pha tƣơng tự nhƣ trên nhƣng chuẩn Enrofloxacin 1000ppm đƣợc pha trong Methanol, các chuẩn còn lại đƣợc pha từ chuẩn Enrofloxacin 1000ppm bằng phƣơng pháp pha loãng trong nƣớc để thu đƣợc dãy đƣờng chuẩn Enrofloxacin 0 5ppm, 1ppm, 2 5ppm, 5ppm và 10ppm
Lấy mẫu máu thực từ heo, thêm vào 0 5% sodium EDTA nhằm giữ cho máu không bị đông lại Ly tâm với tốc độ 6000vòng/phút trong thời gian 10 phút. Tách lấy
huyết tƣơng bảo quản ở nhiệt độ –20oC đến khi phân tích
Tiến hành thêm chuẩn đã pha ở trên vào mẫu huyết tƣơng và tiến hành các quy trình phân tích, chiết tách nhằm xác định hiệu suất chiết tách Xác định hiệu suất thu hồi và lựa chọn quy trình đạt hiệu suất cao để tiến hành khảo sát sự thay đổi hàm lƣợng của Enrofloxacin và Thiamohenicol trong huyết tƣơng theo thời gian
3.2.3 Lựa chọn quy trình
3.2.3.1 Lựa chọn quy trình phân tích Thiamphenicol [14,15,16]
a) Quy trình phân tích Thiamphenicol theo sự chiết tách lỏng – lỏng
Lấy huyết tƣơng đã trích từ máu của heo cho rã đơng ở nhiệt phịng, chuẩn bị mẫu thử nhƣ sau: chuẩn bị 4 mẫu, mẫu T (mẫu trắng) chứa 3 mL huyết tƣơng, 3 mẫu còn lại chứa 2 mL huyết tƣơng và 1 mL chuẩn 20 ppm đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 3. Q trình phân tích đƣợc tiến hành theo quy trình sau nhằm phân tích hàm lƣợng của Thiamphenicol đã thêm vào huyết tƣơng và dựa vào hàm lƣợng đã thêm vào để xác định hiệu suất thu hồi mà quy trình đã thực hiện đƣợc
SVTH Nguyễn Minh Điện 36
Hình 4.3 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng
Thêm 5mL Ethylacetate
970:30
Lắc mạnh, ly tâm 5000 v/ph, 10ph
Thu dịch chiết (lớp trên) Dịch bã (lớp dƣới)
Lặp lại 2 lần
Góp chung dịch chiết, lọc cặn
Thêm 3mL n-hexan, rửa bẩn
Hút bỏ lớp mỡ, thu dịch chiết sạch
Cơ quay chân khơng, 50oC
Hịa tan với 1mL pha động
Lọc 0 45µm, phân tích HPLC Mẫu phân tích
Mơ tả quy trình: Thêm 5 mL Ethylacetate vào từng mẫu phân tích đã chuẩn bị trƣớc nhƣ trên, lắc mạnh một thời gian để Thiamphenicol phân bố vào Ethylacetate, sau đó lấy mẫu đi ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để mẫu tách lớp hoàn toàn
Sau khi ly tâm, tiến hành thu lấy phần dịch chiết ở lớp trên, phần dịch bã đƣợc chiết lại bằng Ethylacetate thêm hai lần nữa để tách hết lƣợng Thiamphenicol đã thêm vào trong mẫu huyết tƣơng Thu và góp chung phần dịch chiết ở ba lần chiết cho từng mẫu phân tích Tiến hành rửa bẩn phần dịch chiết bằng 3 mL n-hexan nhằm loại bỏ hết phần mỡ trong huyết tƣơng lẫn vào dịch chiết Thu dịch chiết đã làm
sạch lọc qua giấy lọc và tráng thật kỹ đem cô quay chân không ở nhiệt độ 50oC cho
đến khi dịch chiết khơ hồn tồn
Sau khi cơ quay xong hịa tan mẫu bằng 1 mL dung dịch pha động Siêu âm và lọc qua đầu lọc 0 45µm rồi cho vào lọ chứa mẫu 2 mL đem phân tích bằng HPLC Phân tích mẫu trên HPLC
Máy HPLC Shimazdu LC – 20AD với đầu dò UV Pha động: Acetonitrile: Nƣớc cất tỷ lệ 1:1
Tốc độ dòng 1 mL/phút Detecter UV 225nm
Cột: RP – C18 Gemini Phenomenex 150 x 4.6 mm, 5µm. Kết quả phân tích
Bảng 4.1 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của Thiamphenicol
Nồng độ 1 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm Diện tích peak 38999 96123 192782 382908 765851 Hệ số hiệu chỉnh 38999 38449.2 38556.4 38290.8 38292.6 SD 291.5543 RSD(%) 0.7569 LOD 0.0254 LOQ 0.0762
SVTH Nguyễn Minh Điện 38 Xây dựng phƣơng trình đƣờng thẳng thể hiện quan hệ giữa nồng độ của Thiamphenicol và diện tích peak đo đƣợc bằng hệ thống HPLC
y = 38249x + 818.66 R2 = 1 0 200000 400000 600000 800000 0 5 10 15 20 25 Nồng độ (ppm) D iệ n tí ch pe ak
Hình 4.4 Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Thiamphenicol
Bảng 4.2 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Thiamphenicol trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng
Mẫu T Mẫu PT
Huyết tƣơng (mL) 3 2
Chuẩn 20ppm (mL) 0 1
Diện tích peak 0 608983
Nồng độ thu hồi (ppm) ------- 15.90
Hiệu suất thu hồi (%) ------- 79.50% Đánh giá quy trình
b) Quy trình phân tích Thiamphenicol theo sự chiết tách pha rắn SPE
Lấy huyết tƣơng đã trích từ máu của heo cho rã đơng ở nhiệt phòng, chuẩn bị mẫu thử nhƣ sau: chuẩn bị 7 mẫu, mẫu T (mẫu trắng) chứa 3 mL huyết tƣơng, các mẫu còn lại mỗi mẫu chứa 2 mL huyết tƣơng và 1 mL chuẩn 20ppm đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 6 Q trình phân tích đƣợc tiến hành theo quy trình sau nhằm phân tích hàm lƣợng của Thiamphenicol đã thêm vào huyết tƣơng và đựa vào hàm lƣợng đã thêm vào để xác định hiệu suất thu hồi mà quy trình đã thực hiện đƣợc
Hình 4.5 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phƣơng pháp chiết tách SPE
Cột SPE
Rửa cột với 5 – 10mL nƣớc Rửa tiếp với 5mL n-hexan
Hòa tan với 1mL pha động
Lọc 0 45μm, phân tích HPLC Làm khơ cột 15 phút
Rửa giải với 10 – 15mL ACN
Thu dịch rửa giải, cơ quay Hoạt hóa lần lƣợt bằng:
5 – 10mL Methanol 5 – 10mL nƣớc cất
SVTH Nguyễn Minh Điện 40
Mơ tả quy trình: Cột SPE StrataTM – X 33µm, polymeric Sorbent đƣợc lần lƣợt hoạt
hóa bằng 5 – 10 mL methanol và 5 – 10 mL nƣớc cất, sau đó cho dịch chiết đã chuẩn bị nhƣ trên chảy qua cột tự nhiên với tốc độ không quá 1 mL/phút Sau khi mẫu chảy hết qua cột tiến hành rửa cột bằng 5 -10 mL nƣớc cất và 5 mL n-hexan nhằm loại bỏ hết tạp chất và mỡ ra khỏi cột
Q trình rửa cột kết thúc, tiến hành làm khơ cột từ từ bằng bơm hút chân không trong thời gian từ 10 – 15 phút Sau đó tiến hành rửa giải Thiamphenicol đã đƣợc giữ lại trên cột bằng 10 – 15 mL Acetonitrile, thu lấy dung dịch rửa giải cho vào
bình cầu, cơ quay chân khơng cho đến khi cạn ở nhiệt độ 50oC.
Sau khi cơ quay xong hịa tan mẫu bằng 1 mL pha động Siêu âm và lọc qua đầu lọc 0.45µm rồi cho vào lọ chứa mẫu 2 mL đem phân tích bằng HPLC
Phân tích mẫu trên HPLC
Máy HPLC Shimazdu LC – 20AD với đầu dò UV Pha động: Acetonitrile: nƣớc cất tỷ lệ 1:1
Tốc độ dòng 1 mL/phút Detecter UV 225nm
Cột: RP – C18 Gemini Phenomenex 150 x 4.6 mm, 5µm. Kết quả phân tích
Bảng 4.3 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Thiamphenicol trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết SPE
Mẫu T Mẫu PT
Huyết tƣơng (mL) 3 2
Chuẩn 20ppm (mL) 0 1
Diện tích peak 0 737134
Nồng độ thu hồi (ppm) ------ 19.2506
Đánh giá quy trình
Quy trình đạt hiệu suất thu hồi cao, giá trị trung bình đạt 96 25% và kết quả ổn định hơn so với quy trình chiết tách lỏng – lỏng, sự sai lệch qua các lần thực hiện chênh lệnh với nhau thấp, có thể xử dụng quy trình trên để tiến hành phân tích dƣ lƣợng Thiamphenicol trong huyết tƣơng heo.
3.2.3.2 Lựa chọn quy trình phân tích Enrofloxacin [17,18,19,20,21,22]
a) Quy trình phân tích Enrofloxacin theo sự chiết tách lỏng – lỏng Quá trình thực hiện tƣơng tự nhƣ trong phân tích Thiamphenicol Q trình thực hiện tƣơng tự nhƣ trong phân tích Thiamphenicol
Lấy huyết tƣơng đã trích từ máu của heo cho rã đơng ở nhiệt phịng, chuẩn bị mẫu thử nhƣ sau: chuẩn bị 6 mẫu, mẫu T (mẫu trắng) chứa 3 mL huyết tƣơng, các mẫu còn lại mỗi mẫu chứa 2 mL huyết tƣơng và 1 mL chuẩn 20ppm đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 5 Quá trình phân tích đƣợc tiến hành theo quy trình sau nhằm phân tích hàm lƣợng của Enrofloxacin đã thêm vào huyết tƣơng và đựa vào hàm lƣợng đã thêm vào để xác định hiệu suất thu hồi mà quy trình đã thực hiện đƣợc
SVTH Nguyễn Minh Điện 42
Hình 4.6 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng
Thêm 5mL Ethylacetate
970:30
Lắc mạnh, ly tâm 5000 v/ph, 10ph
Thu dịch chiết (lớp trên) Bã rắn (lắng xuống)
Lặp lại 2 lần
Góp chung dịch chiết, lọc cặn
Thêm 3mL n-hexan, rửa bẩn
Hút bỏ lớp mỡ, thu dịch chiết sạch
Cô quay chân không, 40oC
Hịa tan với 1mL pha động
Lọc 0 45µm, phân tích HPLC Mẫu phân tích
Mơ tả quy trình: Thêm 5 mL Ethylacetate vào từng mẫu phân tích đã chuẩn bị trƣớc nhƣ trên, lắc mạnh một thời gian để Enrofloxacin phân bố vào Ethylacetate, sau đó lấy mẫu đi ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để mẫu tách lớp hoàn toàn
Sau khi ly tâm, tiến hành thu lấy phần dịch chiết ở phía trên, phần bã rắn đƣợc chiết lại bằng Ethylacetate thêm hai lần nữa để tách hết lƣợng Enrofloxacin đã thêm vào trong mẫu huyết tƣơng Thu và góp chung phần dịch chiết ở ba lần chiết cho từng mẫu phân tích Tiến hành rửa bẩn phần dịch chiết bằng 3 mL n-hexan nhằm loại bỏ hết phần mỡ trong huyết tƣơng lẫn vào dịch chiết Thu dịch chiết đã làm sạch lọc
qua giấy lọc và tráng thật kỹ đem cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC cho đến khi
dịch chiết khơ hồn tồn
Sau khi cơ quay, hịa tan mẫu bằng 1 mL pha động Siêu âm và lọc qua đầu lọc 0.45µm rồi cho vào lọ chứa mẫu 2 mL đem phân tích bằng HPLC
Phân tích mẫu trên HPLC
Máy HPLC Shimazdu LC – 20AD với đầu dò UV Pha động:
Đệm KH2PO4 0 05 M có pH = 2 điều chỉnh bằng H3PO4 (Cân 1.7 g muối
KH2PO4 cho vào bình định mức 250 mL, hòa tan muối bằng nƣớc cất rồi định mức
đến vạch 250, điều chỉnh pH = 2 bằng acid H3PO4 bằng máy đo pH)
A – Đệm KH2PO4 : Acetonitrile tỉ lệ 80 : 20 B – Acetonitrile Tỷ lệ A : B = 50 : 50 Tốc độ dòng 1 mL/phút Detecter UV 290nm Cột: RP – C18 Gemini Phenomenex 150 x 4.6 mm, 5µm.
SVTH Nguyễn Minh Điện 44 Kết quả phân tích
Bảng 4.4 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của Enrofloxacin
Nồng độ 0.5 ppm 1 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm Diện tích peak 30255 60356 149894 305370 602297 Hệ số hiệu chỉnh 60510 60356 59957.6 61074 60229.7 SD 415.2682 RSD (%) 0.6872 LOD 0.0251 LOQ 0.0752
Xây dựng phƣơng trình đƣờng thẳng thể hiện quan hệ giữa nồng độ của Enrofloxacin và diện tích peak đo đƣợc bằng hệ thống HPLC
y = 60315x + 438 R2 = 0.9999 0 200000 400000 600000 0 2 4 6 8 10 Nồng độ (ppm) D iệ n tí ch pe ak
Bảng 4.5 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Enrofloxacin trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết tách lỏng – lỏng
Mẫu T Mẫu PT
Huyết tƣơng ( mL) 3 2
Chuẩn 20ppm ( mL) 0 1
Diện tích peak 0 701649.2
Nồng độ thu hồi (ppm) ------ 11.6258
Hiệu suất thu hồi (%) ------ 58.13% Đánh giá quy trình
Quy trình thực hiện đơn giãn song hiệu suất thu hồi khơng cao b) Quy trình phân tích Enrofloxacin theo sự chiết tách pha rắn SPE
Lấy huyết tƣơng đã trích từ máu của heo cho rã đơng ở nhiệt phịng, chuẩn bị mẫu thử nhƣ sau: chuẩn bị 7 mẫu, mẫu T (mẫu trắng) chứa 3mL huyết tƣơng, các mẫu còn lại mỗi mẫu chứa 2 mL huyết tƣơng và 1 mL chuẩn 20ppm đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 6 Q trình phân tích đƣợc tiến hành theo quy trình sau nhằm phân tích hàm lƣợng của Enrofloxacin đã thêm vào huyết tƣơng và đựa vào hàm lƣợng đã thêm vào để xác định hiệu suất thu hồi mà quy trình đã thực hiện đƣợc
SVTH Nguyễn Minh Điện 46
Hình 4.8 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phƣơng pháp chiết tách SPE
Mơ tả quy trình: Cột SPE StrataTM
– X 33µm, polymeric Sorbent đƣợc lần lƣợt hoạt hóa bằng 5 – 10 mL methanol và 5 – 10 mL nƣớc cất, sau đó cho dịch chiết đã chuẩn bị nhƣ trên chảy qua cột tự nhiên với tốc độ không quá 1 mL/phút Sau khi mẫu chảy hết qua cột tiến hành rửa cột bằng 5 – 10 mL nƣớc cất và 5 mL n-hexan nhằm loại bỏ hết tạp chất và mỡ ra khỏi cột