Lấy huyết tƣơng đã trích từ máu của heo cho rã đơng ở nhiệt phịng, chuẩn bị mẫu thử nhƣ sau: chuẩn bị 4 mẫu, mẫu T (mẫu trắng) chứa 3 mL huyết tƣơng, 3 mẫu còn lại chứa 2 mL huyết tƣơng và 1 mL chuẩn 20 ppm đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 3. Quá trình phân tích đƣợc tiến hành theo quy trình sau nhằm phân tích hàm lƣợng của Thiamphenicol đã thêm vào huyết tƣơng và dựa vào hàm lƣợng đã thêm vào để xác định hiệu suất thu hồi mà quy trình đã thực hiện đƣợc
SVTH Nguyễn Minh Điện 36
Hình 4.3 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng
Thêm 5mL Ethylacetate
970:30
Lắc mạnh, ly tâm 5000 v/ph, 10ph
Thu dịch chiết (lớp trên) Dịch bã (lớp dƣới)
Lặp lại 2 lần
Góp chung dịch chiết, lọc cặn
Thêm 3mL n-hexan, rửa bẩn
Hút bỏ lớp mỡ, thu dịch chiết sạch
Cơ quay chân khơng, 50oC
Hịa tan với 1mL pha động
Lọc 0 45µm, phân tích HPLC Mẫu phân tích
Mơ tả quy trình: Thêm 5 mL Ethylacetate vào từng mẫu phân tích đã chuẩn bị trƣớc nhƣ trên, lắc mạnh một thời gian để Thiamphenicol phân bố vào Ethylacetate, sau đó lấy mẫu đi ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để mẫu tách lớp hoàn toàn
Sau khi ly tâm, tiến hành thu lấy phần dịch chiết ở lớp trên, phần dịch bã đƣợc chiết lại bằng Ethylacetate thêm hai lần nữa để tách hết lƣợng Thiamphenicol đã thêm vào trong mẫu huyết tƣơng Thu và góp chung phần dịch chiết ở ba lần chiết cho từng mẫu phân tích Tiến hành rửa bẩn phần dịch chiết bằng 3 mL n-hexan nhằm loại bỏ hết phần mỡ trong huyết tƣơng lẫn vào dịch chiết Thu dịch chiết đã làm
sạch lọc qua giấy lọc và tráng thật kỹ đem cô quay chân không ở nhiệt độ 50oC cho
đến khi dịch chiết khơ hồn tồn
Sau khi cơ quay xong hịa tan mẫu bằng 1 mL dung dịch pha động Siêu âm và lọc qua đầu lọc 0 45µm rồi cho vào lọ chứa mẫu 2 mL đem phân tích bằng HPLC Phân tích mẫu trên HPLC
Máy HPLC Shimazdu LC – 20AD với đầu dò UV Pha động: Acetonitrile: Nƣớc cất tỷ lệ 1:1
Tốc độ dòng 1 mL/phút Detecter UV 225nm
Cột: RP – C18 Gemini Phenomenex 150 x 4.6 mm, 5µm. Kết quả phân tích
Bảng 4.1 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của Thiamphenicol
Nồng độ 1 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm Diện tích peak 38999 96123 192782 382908 765851 Hệ số hiệu chỉnh 38999 38449.2 38556.4 38290.8 38292.6 SD 291.5543 RSD(%) 0.7569 LOD 0.0254 LOQ 0.0762
SVTH Nguyễn Minh Điện 38 Xây dựng phƣơng trình đƣờng thẳng thể hiện quan hệ giữa nồng độ của Thiamphenicol và diện tích peak đo đƣợc bằng hệ thống HPLC
y = 38249x + 818.66 R2 = 1 0 200000 400000 600000 800000 0 5 10 15 20 25 Nồng độ (ppm) D iệ n tí ch pe ak
Hình 4.4 Phƣơng trình đƣờng chuẩn của Thiamphenicol
Bảng 4.2 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Thiamphenicol trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng
Mẫu T Mẫu PT
Huyết tƣơng (mL) 3 2
Chuẩn 20ppm (mL) 0 1
Diện tích peak 0 608983
Nồng độ thu hồi (ppm) ------- 15.90
Hiệu suất thu hồi (%) ------- 79.50% Đánh giá quy trình