Q trình thực hiện tƣơng tự nhƣ trong phân tích Thiamphenicol
Lấy huyết tƣơng đã trích từ máu của heo cho rã đơng ở nhiệt phịng, chuẩn bị mẫu thử nhƣ sau: chuẩn bị 6 mẫu, mẫu T (mẫu trắng) chứa 3 mL huyết tƣơng, các mẫu còn lại mỗi mẫu chứa 2 mL huyết tƣơng và 1 mL chuẩn 20ppm đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 5 Q trình phân tích đƣợc tiến hành theo quy trình sau nhằm phân tích hàm lƣợng của Enrofloxacin đã thêm vào huyết tƣơng và đựa vào hàm lƣợng đã thêm vào để xác định hiệu suất thu hồi mà quy trình đã thực hiện đƣợc
SVTH Nguyễn Minh Điện 42
Hình 4.6 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phƣơng pháp chiết lỏng – lỏng
Thêm 5mL Ethylacetate
970:30
Lắc mạnh, ly tâm 5000 v/ph, 10ph
Thu dịch chiết (lớp trên) Bã rắn (lắng xuống)
Lặp lại 2 lần
Góp chung dịch chiết, lọc cặn
Thêm 3mL n-hexan, rửa bẩn
Hút bỏ lớp mỡ, thu dịch chiết sạch
Cô quay chân khơng, 40oC
Hịa tan với 1mL pha động
Lọc 0 45µm, phân tích HPLC Mẫu phân tích
Mơ tả quy trình: Thêm 5 mL Ethylacetate vào từng mẫu phân tích đã chuẩn bị trƣớc nhƣ trên, lắc mạnh một thời gian để Enrofloxacin phân bố vào Ethylacetate, sau đó lấy mẫu đi ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để mẫu tách lớp hoàn toàn
Sau khi ly tâm, tiến hành thu lấy phần dịch chiết ở phía trên, phần bã rắn đƣợc chiết lại bằng Ethylacetate thêm hai lần nữa để tách hết lƣợng Enrofloxacin đã thêm vào trong mẫu huyết tƣơng Thu và góp chung phần dịch chiết ở ba lần chiết cho từng mẫu phân tích Tiến hành rửa bẩn phần dịch chiết bằng 3 mL n-hexan nhằm loại bỏ hết phần mỡ trong huyết tƣơng lẫn vào dịch chiết Thu dịch chiết đã làm sạch lọc
qua giấy lọc và tráng thật kỹ đem cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC cho đến khi
dịch chiết khơ hồn tồn
Sau khi cơ quay, hịa tan mẫu bằng 1 mL pha động Siêu âm và lọc qua đầu lọc 0.45µm rồi cho vào lọ chứa mẫu 2 mL đem phân tích bằng HPLC
Phân tích mẫu trên HPLC
Máy HPLC Shimazdu LC – 20AD với đầu dò UV Pha động:
Đệm KH2PO4 0 05 M có pH = 2 điều chỉnh bằng H3PO4 (Cân 1.7 g muối
KH2PO4 cho vào bình định mức 250 mL, hịa tan muối bằng nƣớc cất rồi định mức
đến vạch 250, điều chỉnh pH = 2 bằng acid H3PO4 bằng máy đo pH)
A – Đệm KH2PO4 : Acetonitrile tỉ lệ 80 : 20 B – Acetonitrile Tỷ lệ A : B = 50 : 50 Tốc độ dòng 1 mL/phút Detecter UV 290nm Cột: RP – C18 Gemini Phenomenex 150 x 4.6 mm, 5µm.
SVTH Nguyễn Minh Điện 44 Kết quả phân tích
Bảng 4.4 Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của Enrofloxacin
Nồng độ 0.5 ppm 1 ppm 2.5 ppm 5 ppm 10 ppm Diện tích peak 30255 60356 149894 305370 602297 Hệ số hiệu chỉnh 60510 60356 59957.6 61074 60229.7 SD 415.2682 RSD (%) 0.6872 LOD 0.0251 LOQ 0.0752
Xây dựng phƣơng trình đƣờng thẳng thể hiện quan hệ giữa nồng độ của Enrofloxacin và diện tích peak đo đƣợc bằng hệ thống HPLC
y = 60315x + 438 R2 = 0.9999 0 200000 400000 600000 0 2 4 6 8 10 Nồng độ (ppm) D iệ n tí ch pe ak
Bảng 4.5 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Enrofloxacin trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết tách lỏng – lỏng
Mẫu T Mẫu PT
Huyết tƣơng ( mL) 3 2
Chuẩn 20ppm ( mL) 0 1
Diện tích peak 0 701649.2
Nồng độ thu hồi (ppm) ------ 11.6258
Hiệu suất thu hồi (%) ------ 58.13% Đánh giá quy trình
Quy trình thực hiện đơn giãn song hiệu suất thu hồi khơng cao b) Quy trình phân tích Enrofloxacin theo sự chiết tách pha rắn SPE
Lấy huyết tƣơng đã trích từ máu của heo cho rã đơng ở nhiệt phịng, chuẩn bị mẫu thử nhƣ sau: chuẩn bị 7 mẫu, mẫu T (mẫu trắng) chứa 3mL huyết tƣơng, các mẫu còn lại mỗi mẫu chứa 2 mL huyết tƣơng và 1 mL chuẩn 20ppm đƣợc đánh số thứ tự từ 1 đến 6 Q trình phân tích đƣợc tiến hành theo quy trình sau nhằm phân tích hàm lƣợng của Enrofloxacin đã thêm vào huyết tƣơng và đựa vào hàm lƣợng đã thêm vào để xác định hiệu suất thu hồi mà quy trình đã thực hiện đƣợc
SVTH Nguyễn Minh Điện 46
Hình 4.8 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phƣơng pháp chiết tách SPE
Mơ tả quy trình: Cột SPE StrataTM
– X 33µm, polymeric Sorbent đƣợc lần lƣợt hoạt hóa bằng 5 – 10 mL methanol và 5 – 10 mL nƣớc cất, sau đó cho dịch chiết đã chuẩn bị nhƣ trên chảy qua cột tự nhiên với tốc độ không quá 1 mL/phút Sau khi mẫu chảy hết qua cột tiến hành rửa cột bằng 5 – 10 mL nƣớc cất và 5 mL n-hexan nhằm loại bỏ hết tạp chất và mỡ ra khỏi cột
Quá trình rửa cột kết thúc, tiến hành làm khô cột từ từ bằng bơm hút chân không trong thời gian từ 10 – 15 phút Sau đó tiến hành rửa giải Enrofloxacin đã đƣợc giữ lại trên cột bằng 10 – 15 mL Acetonitrile, thu lấy dung dịch rửa giải cho vào bình
cầu, cô quay chân không cho đến khi cạn ở nhiệt độ 50o
C.
Sau khi cơ quay xong hịa tan mẫu bằng 1 mL pha động Siêu âm và lọc qua đầu lọc 0 45µm rồi cho vào lọ chứa mẫu 2 mL đem phân tích bằng HPLC
Cột SPE
Rửa cột với 5 – 10mL nƣớc Rửa tiếp với 5mL n-hexan
Hòa tan với 1mL pha động
Lọc 0 45μm, phân tích HPLC Làm khơ cột 15 phút
Rửa giải với 10 – 15mL ACN
Thu dịch rửa giải, cơ quay Hoạt hóa lần lƣợt bằng:
5 – 10mL Methanol 5 – 10mL nƣớc cất
Phân tích mẫu trên HPLC
Máy HPLC Shimazdu LC – 20AD với đầu dò UV Pha động: Đệm KH2PO4 0 05 M có pH = 2 điều chỉnh bằng H3PO4. A – Đệm KH2PO4 : Acetonitrile tỉ lệ 80 : 20 B – Acetonitrile Tỷ lệ A : B = 50 : 50 Tốc độ dòng 1 mL/phút Detecter UV 290nm Cột: RP – C18 Gemini Phenomenex 150 x 4.6 mm, 5µm. Kết quả phân tích
Bảng 4.6 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Enrofloxacin trong huyết tƣơng bằng phƣơng pháp chiết SPE
Mẫu T Mẫu PT
Huyết tƣơng (mL) 3 2
Chuẩn 20ppm (mL) 0 1
Diện tích peak 0 999346.2
Nồng độ thu hồi (ppm) ------ 16.5615
Hiệu suất thu hồi (%) ------ 82.81% Đánh giá quy trình
Quy trình đạt hiệu suất thu hồi cao hơn so với quy trình chiết lỏng – lỏng, giá trị trung bình đạt 82 81%, có thể xử dụng quy trình trên để tiến hành phân tích dƣ lƣợng Enrofloxacin trong huyết tƣơng heo.
3.2.4 Đánh giá quy trình
Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phƣơng pháp chiết tách SPE và phân tích HPLC có hiệu suất thu hồi rất cao, hiệu suất trung bình đạt 96 25%, quy trình có độ tuyến tính cao, hệ số tƣơng quan R = 1, giới hạn phát hiện LOD = 0 0245 ppm, giới hạn định lƣợng LOQ = 0 0762 ppm Nhƣ vậy quy trình này đƣợc sử dụng để khảo sát hàm lƣợng của Thiamphenicol trong huyết tƣơng heo.
SVTH Nguyễn Minh Điện 48 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phƣơng pháp chiết tách SPE và phân tích HPLC có hiệu suất thu hồi cao, hiệu suất trung bình đạt 82 81%, quy trình có độ tuyến tính cao, hệ số tƣơng quan R2 = 0 9999 (R = 0 99995), giới hạn phát hiện LOD = 0 0251 ppm, giới hạn định lƣợng LOQ = 0 0752 ppm Có thể sử dụng quy trình này để khảo sát hàm lƣợng của Enrofloxacin trong huyết tƣơng heo.
3.3 Khảo sát sự thay đổi hàm lƣợng của Enrofloxacin và Thiamphenicol
3.3.1 Mục đích
Khảo sát sự thay đổi hàm lƣợng Enrofloxacin và Thiamphenicol còn lại trong huyết tƣơng heo theo thời gian
3.3.2 Phương pháp tiến hành khảo sát
3.3.2.1 Khảo sát hàm lượng của Thiamphenicol
Đối tƣợng khảo sát: Heo có thể trọng khoảng 35kg
Số lƣợng khảo sát: 06 con, trong đó 03 con đƣợc khảo sát với thuốc do công ty Vemedim sản xuất, 03 con còn lại khảo sát với thuốc do công ty khác sản xuất Thuốc dùng khảo sát:
Thuốc của công ty Vemedim sản xuất: VIMEXYSON COD (10gThiamphenicol/100 mL dung dịch)
Thuốc của công ty khác sản xuất (10g Thiamphenicol/100 mL dung dịch). Liều lƣợng tiêm: 7 mL/con
Thời gian tiêm: 8h10, ngày 01/3/2011
Địa điểm tiến hành: Trại thử nghiệm, công ty Vemedim, quận Ơ Mơn, thành phố Cần Thơ
Thời gian lấy mẫu: sau khi tiêm thuốc 1 giờ, 6 giờ, 24 giờ và 48 giờ tiến hành lấy mẫu máu về phân tích
Mẫu máu sau khi lấy từ heo thử nghiệm đƣợc thêm vào 0 5% sodium EDTA nhằm giữ cho máu không bị đông lại Ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút Tách lấy huyết tƣơng bảo quản ở nhiệt độ – 20oC đến khi phân tích
Tiến hành phân tích hàm lƣợng của Thiamphenicol trong huyết tƣơng thu đƣợc bằng phƣơng pháp chiết SPE và phân tích HPLC theo quy trình đã xây dựng ở trên Sau đó xác định hàm lƣợng Thiamphenicol còn lại trong huyết tƣơng theo công thức:
Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 38249x + 818.66
Ta có nồng độ cịn lại của Thiamphenicol trong mẫu khảo sát:
CThiam HT= y−818 . 66
38249 ×V2
V1×H× HSPL
Trong đó CThiam HT – là nồng độ Thiamphenicol có trong huyết tƣơng
H: là hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích đã xây dựng H% = 96.25%
HSPL – là hệ số pha loãng y là diện tích peak đo đƣợc
V1 – là thể tích huyết tƣơng ban đầu V2 – là thể tích định mức.
Kết quả khảo sát đƣợc trình bày qua biễu bảng và đồ thị nhƣ sau:
Bảng 4.7 Kết quả phân tích hàm lƣợng Thiamphenicol trung bình trong huyết tƣơng với thuốc Vemexyson COD của Công ty Vemedim.
Đại lƣợng Thời gian
V(mL)
Huyết tƣơng Diện tích peak
C (ppm) thu hồi 1h sau tiêm 4.5 262425 6.2700 6h sau tiêm 5 514971 2.7932 24h sau tiêm 5.6 18343 0.0850 48h sau tiêm 5.7 15461 0.0698
SVTH Nguyễn Minh Điện 50
Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lƣợng Thiamphenicol trung bình trong huyết tƣơng với thuốc của Công ty khác.
Đại lƣợng Thời gian
V(mL)
Huyết tƣơng Diện tích peak
C (ppm) thu hồi 1h sau tiêm 6 444216 8.0742 6h sau tiêm 6.8 259091 1.0317 24h sau tiêm 6.6 54273 0.2200 48h sau tiêm 6.8 38063 0.1488
Biếu diễn kết quả tính tốn trên đồ thị về hàm lƣợng cịn lại của Enrofloxacin theo thời gian
Hình 4.9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ Thiamphenicol trong huyết tƣơng theo thời gian.
Nhận xét – đánh giá
Từ bảng kết quả và đồ thị trên cho ta thấy, Thiamphenicol hấp thu nhanh qua đƣờng tiêm, nồng độ thuốc đạt mức cao trong thời gian 1 giờ đầu sau tiêm, và sau đó nồng độ Thiamphenicol trong máu giảm rất nhanh
Khoảng thời gian từ sau 48 giờ sau tiêm thì nồng đồ Enrofloxacin vẫn cịn tồn tại trong máu ở mức thấp Đối với thực nghiệm với thuốc Vemexyson COD thì nồng độ Thiamphenicol cịn lại gần bằng giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp, LOQ = 0.0762) Còn đối với thực nghiệm với thuốc của cơng ty khác sản xuất thì nồng độ Thiamphenicol còn lại ở 48 giờ sau tiêm vẫn còn cao hơn (0 0698 ppm đối với thuốc Vemexyson COD và 0 1488 ppm đối với thuốc của công ty khác).
Giới hạn dƣ lƣợng tối đa cho phép (MRL, Maximum Residue Limits) của
Thiamphenicol là 50 µg/kg thể trọng, tƣơng ứng với 0 05 mg/kg thể trọng [TL24]
So sánh giữa thuốc của công ty Vemedim (Vemexyson COD) và công ty khác cho kết quả nhƣ sau: thời gian sau tiêm thuốc đƣợc 1 giờ thì nồng độ Thiamphenicol trong máu của vật nuôi thử nghiệm trong thực nghiệm dùng thuốc của công ty khác cao hơn trong thực nghiệm dùng thuốc Vemexyson COD.
Trong giai đoạn đầu khảo sát (từ 1 giờ - 6 giờ): nồng độ Thiamphenicol trong máu giảm rất nhanh, trong đó ở giai đoạn này thì nồng độ Thiamphenicol trong máu khi sử dụng thuốc của công ty khác giảm nhanh hơn so với khi sử dụng thuốc Vemexyson COD (Vemexyson COD giảm 2.3 lần, thuốc của công ty khác giảm 7 6 lần)
Song giai đoạn từ 6 giờ đến 24 giờ, nồng độ Thiamphenicol trong máu khi sử dụng thuốc của công ty khác giảm chậm lại hơn so với khi sử dụng thuốc Vemexyson COD (Vemexyson COD giảm 32.8 lần, Thuốc của công ty khác giảm 4.7 lần) Giai đoạn từ 24 giờ đến 48 giờ, tốc độ giảm nồng độ Thiamphenicol trong máu đối với hai loại thuốc là gần nhƣ nhau (Vemexyson COD giảm 1 2 lần, thuốc của công ty khác giảm 1 5 lần)
Nhƣ vậy, từ đồ thị cho ta rút ra kết luận, khi sử dụng thuốc Vemexyson COD có tác dụng kéo dài hơn so với khi sử dụng thuốc do công ty khác sản xuất
3.3.2.2 Khảo sát hàm lượng của Enrofloxacin
Đối tƣợng khảo sát: Heo có thể trọng khoảng 40kg
Số lƣợng khảo sát: 04 con, trong đó 03 con đƣợc khảo sát với thuốc do công ty Vemedim sản xuất, 03 con cịn lại khảo sát với thuốc do cơng ty khác sản xuất Thuốc dùng khảo sát:
Thuốc của công ty Vemedim sản xuất: Vemetryl 5 (5g Enrofloxacin/100 mL dung dịch)
Thuốc của công ty khác sản xuất (5g Enrofloxacin/100 mL dung dịch) Liều lƣợng tiêm: 4 mL/con.
Thời gian tiêm: 8h15, ngày 15/02/2011
Địa điểm tiến hành: Trại thử nghiệm, cơng ty Vemedim, quận Ơ Mơn, thành phố Cần Thơ
Thời gian lấy mẫu: sau khi tiêm thuốc 1 giờ, 6 giờ, 24 giờ và 48 giờ tiến hành lấy mẫu máu về phân tích
SVTH Nguyễn Minh Điện 52 Mẫu máu sau khi lấy từ heo thử nghiệm đƣợc thêm vào 0 5% sodium EDTA nhằm giữ cho máu không bị đơng lại Ly tâm với tốc độ 6000 vịng/phút Tách lấy huyết tƣơng bảo quản ở nhiệt độ – 20oC đến khi phân tích
Tiến hành phân tích hàm lƣợng của Enrofloxacin trong huyết tƣơng thu đƣợc bằng phƣơng pháp chiết SPE và phân tích HPLC theo quy trình đã xây dựng ở trên Sau đó xác định hàm lƣợng Enrofloxacin cịn lại trong huyết tƣơng theo cơng thức: Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 60315x + 438
Ta có nồng độ cịn lại của Enrofloxacin trong mẫu khảo sát:
HSPL H V V y = C 1 2 HT Enro 60315 438
Trong đó CEnro HT – là nồng độ Enrofloxacin có trong huyết tƣơng
H% - là hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích đã xây dựng H% = 82.81%
HSPL – là hệ số pha lỗng mẫu y – là diện tích peak đo đƣợc
V1 – là thể tích huyết tƣơng ban đầu
V2 – là thể tích cuối của q trình phân tích V2 = 1 mL Kết quả khảo sát đƣợc trình bày qua biễu bảng và đồ thị nhƣ sau:
Bảng 4.9 Kết quả phân tích hàm lƣợng Enrofloxacin trung bình trong huyết tƣơng với thuốc Vemetryl 5 của Công ty Vemedim.
Đại lƣợng Thời gian
V(mL)
Huyết tƣơng Diện tích peak
C (ppm) thu hồi 1h sau tiêm 3.25 269820 1.6595 6h sau tiêm 5 288746 1.1545 24h sau tiêm 3.75 82080.5 0.4359 48h sau tiêm 5 34788 0.1375
Bảng 4.10 Kết quả phân tích hàm lƣợng Enrofloxacin trung bình trong huyết tƣơng với thuốc của Công ty khác.
Đại lƣợng Thời gian
V(mL)
Huyết tƣơng Diện tích peak
C (ppm) thu hồi 1h sau tiêm 5 209116.5 0.8356 6h sau tiêm 4.5 159533 0.7078 24h sau tiêm 4.75 40236.5 0.1678 48h sau tiêm 5 25596 0.1007
Biếu diễn kết quả tính tốn trên đồ thị về hàm lƣợng còn lại của Enrofloxacin theo thời gian 0 0.4 0.8 1.2 1.6 0 10 20 30 40 50 Thời gian (h) N ồn g độ ( pp m )
Thuốc của công ty Vemedim
Thuốc của cơng ty khác
Hình 4.10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ Enrofloxacin còn lại trong huyết tƣơng theo thời gian.
Nhận xét – đánh giá
Từ bảng kết quả và đồ thị trên cho ta thấy, Enrofloxacin hấp thu nhanh qua đƣờng tiêm, nồng độ thuốc đạt mức cao trong thời gian 1 giờ đầu sau tiêm và vẫn duy trì nồng độ có hiệu lực trong 24 giờ sau tiêm
Nồng độ Enrofloxacin giảm đi một nữa trong khoảng thời gian từ 14 – 16 giờ sau tiêm Do điều kiện khảo sát và thời gian không cho phép nên không thể tiến hành khảo sát chính xác thời gian bán phân hủy của thuốc Dựa vào đồ thị ta thấy, thời gian bán phân hủy của hai loại thuốc gần bằng nhau
SVTH Nguyễn Minh Điện 54 Khoảng thời gian từ sau 48 giờ sau tiêm thì nồng độ Enrofloxacin vẫn cịn tồn tại trong máu ở mức thấp, C = 0.1007 ppm (gần bằng giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp, LOQ = 0 0752), điều này cho phép kết thúc quá trình khảo sát vì quá trình