Trong đó:
X: hàm lượng tannin xác định trên khối lượng chất khô (%). a: lượng KMnO4 chuẩn độ ở bình thí nghiệm (ml).
b: lượng KMnO4 chuẩn độ ở bình đối chứng (ml). V: thể tích tồn bộ dịch chiết (250ml).
v: thể tích dịch chiết dùng để phân tích (10ml). c: khối lượng mẫu đem phân tích (g).
k: hệ số tannin (0,00582).
Ghi nhận kết quả
- Hàm lượng tannin trên khối lượng chất khô (%). - Xác định khối lượng vật chất khô của thực liệu.
b. Định lƣợng tannin bằng phƣơng pháp Loventhal II
c Định lƣợng tannin bằng phƣơng pháp Loventhal II[34] Mục đích:
- Xác định hàm lượng tannin trên khối lượng chất khô (%). - Xác định khối lượng vật chất khô của thực liệu.
Tiến hành thí nghiệm
Cân 2g thực liệu khơ cho vào cối sứ nghiền kỹ, thêm vào đó khoảng 50-60 ml nước cất đun sôi, lọc lấy nước cho vào bình định mức dung tích 250ml, thêm nước cất đến vạch định mức, lắc kỹ. Tiến hành định lượng. Kết quả được tính theo biểu thức.
Đun cách thủy
Sơ đồ 3.2: Quy trình phân tích tannin bằng phương pháp Loventhal I 80oC khoảng 15 phút Dùng FeCl3 5% để thử tannin Để yên 5 phút lọc bằng giấy lọc Thực liệu khô Định lƣợng Lọc mẫu
G V k V b a X 1 100 ) ( % Trong đó:
X: hàm lượng tannin xác định trên khối lượng chất khô (%).
a: lượng KMnO4 chuẩn mẫu thử (ml).
b: lượng KMnO4 chuẩn mẫu trắng (ml).
V: thể tích tồn bộ dịch chiết (ml).
V1: thể tích dịch chiết dùng để phân tích (ml). G: khối lượng mẫu đem phân tích (g).
k: hệ số tannin (0,00478).
Ghi nhận kết quả
- Hàm lượng tannin trên khối lượng chất khô (%). - Xác định khối lượng vật chất khô của thực liệu.
d Định lƣợng tannin bằng phƣơng pháp oxy hóa (DĐVN I)[30] Mục đích:
- Xác định hàm lượng tannin trên khối lượng chất khô (%). - Xác định khối lượng vật chất khô của thực liệu.
Cối (đựng mẫu) Nước cất đun sôi ở
100oC
Sơ đồ 3.3: Quy trình phân tích tannin bằng phương pháp Loventhal II Dùng FeCl3 5%
để thử tannin Xử lý sạch (phân loại) bằng rây Thực liệu khơ
Lọc mẫu
Tiến hành thí nghiệm Mơ tả
Cân chính xác 2g thực liệu đã tán nhỏ qua rây số 355 (kích thước mắt rây 0,355mm) cho vào 1 bình nón. Đổ thêm 50ml nước sơi và đun cách thủy, vừa đun vừa khuấy trong 30 phút. Để yên vài phút rồi lọc qua bơng vào một bình định mức 250ml. Chú ý đừng để thực liệu rơi trên bông. Tiếp tục chiết như trên vài lần cho tới khi dịch
chiết không cho phản ứng với dung dịch FeCl3. Để nguội rồi cho thêm nước vào bình
định mức tới vạch. Tiến hành định lượng. Kết quả được tính theo biểu thức.
Trong đó:
X: hàm lượng tannin xác định trên khối lượng chất khô (%).
a: lượng KMnO4 chuẩn mẫu thử (ml).
b: lượng KMnO4 chuẩn mẫu trắng (ml). V: thể tích tồn bộ dịch chiết (ml).
v: thể tích dịch chiết dùng để phân tích (ml). G: khối lượng mẫu đem phân tích (g).
k: hệ số tannin (0,004157).
Đun cách thủy
Sơ đồ 3.4: Quy trình phân tích tannin bằng phương pháp oxy hóa (DĐVN I)
Lọc bằng bơng Dùng FeCl3 5% để thử tannin Khoảng 30 phút, để yên 5 phút Rây thực liệu (0,355mm) Thực liệu khô Định lƣợng Lọc mẫu G V k V b a X 1 100 ) ( %
e Định lƣợng tannin bằng phƣơng pháp bột da (DĐVN IV)[30]
Mục đích:
- Xác định hàm lượng tannin trong thực liệu khô (%). - Xác định phần chất chiết được trong nước T1 (g).
- Xác định chất chiết được trong nước không liên kết với bột da T2 (g). - Xác định chất chiết được trong nước liên kết với bột da T0 (g).
Tiến hành thí nghiệm
Cân chính xác một khối lượng thực liệu đã rây qua rây số 355 (kích thước mắt rây 0,355mm) và chứa khoảng 1g tannin, cho vào 1 bình nón, thêm 150ml nước và đun trên cách thủy trong 30 phút. Để nguội, chuyển hỗn hợp vào bình định mức 250ml, thêm nước vừa đủ tới vạch, lọc. Dịch lọc này dùng làm dung dịch thử.
Định lượng toàn phần chất chiết được trong nước: lấy chính xác 25ml dung dịch thử đem bốc hơi đến khô, sấy cắn ở 1050C trong 3 giờ. Cân, được khối lượng T1 (g).
Định lượng chất chiết được trong nước không liên kết với bột da: lấy chính xác 100 ml dung dịch thử, thêm 6g bột da khô (TT). Lắc đều trong 15 phút và lọc. Lấy chính xác 25ml dịch lọc đem bốc hơi đến khơ, sấy cắn ở 1050C trong 3 giờ. Cân, được khối lượng T2 (g).
Định lượng chất chiết được trong thực liệu liên kết với bột da: lấy chính xác 100ml nước cất, thêm 6 g bột da khô (TT). Lắc đều trong 15 phút và lọc. Lấy chính xác 25ml dịch lọc bốc hơi đến khô, sấy cắn ở 1050C trong 3 giờ. Cân được khối lượng T0 (g). Kết quả được tính theo biểu thức.
Đun cách thủy
Sơ đồ 3.4: Quy trình phân tích tannin bằng phương pháp bột da (DĐVN IV) Sấy ở nhiệt độ ổn định 30o C Sấy ổn định ở 150oC Lọc mẫu Tính trên DM Khoảng 30 phút, để nguội Rây Cân mẫu (sau sấy) Thực liệu
sau khi rây Sấy khô
% 1 2 010100 a T T T T Trong đó:
T: hàm lượng tannin xác định trên khối lượng chất khô (%). T1: phần chất chiết được trong nước(g).
T2: phần chất chiết được trong nước không liên kết với bột da(g). T0: phần chất chiết được trong nước liên kết với bột da (g).
a: khối lượng thực liệu khô (g).
Ghi nhận kết quả
- Hàm lượng tannin trong thực liệu khô (%). - Phần chất chiết được trong nước T1 (g).
- Chất chiết được trong nước không liên kết với bột da T2 (g). - Chất chiết được trong nước liên kết với bột da T0 (g).
e Xử lý số liệu
- Số liệu thành phần dưỡng chất của thực liệu được ghi nhận và xử lý bằng chương trình Microsoft Excell 2007. Các thực liệu được tiến hành phân tích với 3 lần lặp lại và lấy kết quả trung bình.
- Số liệu của các phương pháp phân tích tannin được xử lý bằng phương pháp thống kê mô tả (desciptive statistics) và so sánh sự khác nhau giữa các phương pháp bằng Two Test Sample Minitab Version 13
3.2.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng của tannin lên sự sản sinh khí methane bằng phƣơng pháp in vitro
3.2.2.1 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí thừa số 2 nhân tố. Nhân tố 1: các loại thực liệu (rơm, cỏ lông tây, cỏ đậu). Nhân tố 2: bổ sung và khơng có bổ sung tannin. Bổ sung tannin ở mức 8% tính trên vật chất khô của mẫu.
3.2.2.2 Hệ thống in vitro
Hệ thống in vitro được sử dụng để đánh giá sự lên men và sinh khí của vi sinh vật trong môi trường dịch dạ cỏ. Hệ thống bao gồm 1 bình chứa chất nền (mẫu thử, dịch dạ cỏ và dung dịch đệm) và 1 bình chứa khí sinh ra thơng qua ống dẫn khí được kết nối giữa 2 bình. Sau khi cho mẫu và dịch dạ cỏ vào thì khí oxi trong bình được đẩy
ra bằng cách sử dụng khí
CO2, để tạo điều kiện yếm
khí cho mơi trường ủ.
3.2.2.3 Chuẩn bị mẫu và dịch dạ cỏ
Loại thực liệu được sử dụng trong thí nghiệm in vitro là cỏ lông tây, cỏ đậu và
rơm. Các loại thực liệu này được sấy ở 600C và được nghiền nhỏ khoảng 1mm trước
khi dùng làm chất nền. Mỗi bình ủ, chất nền được sử dụng là 20g mẫu (tính theo OM) và tỷ lệ dịch dạ cỏ với dung dịch đệm là 1:2, với tổng thể tích là 1,5 lít. Mỗi bình ủ được đặt trong water bath với nhiệt độ là 390C và ủ trong 96 giờ. Thí nghiệm gồm có 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
3.2.2.4 Chỉ tiêu theo dõi
Khí sinh ra được tính bằng cách đo khoảng cách mực nước trong bình chứa khí giảm xuống. Phần trăm khí methane sinh ra được đo ở các thời điểm 6, 12, 18, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84 và 96 giờ bằng máy infra - red meter (Crowcon Ltd, UK)
3.2.2.5 Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý sơ bộ trên Microsoft Excell 2007 và sau đó được xử lý bằng
mơ hình General Linear Model và so sánh sự khác biệt ở các cặp nghiệm thức bằng phương pháp Tukey của chương trình Minitab 13.