5. Ý ng ha thực tiễn của đề tài
2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu
Tổng hợp nano đồng từ CuSO4 bằng phƣơng pháp khử hóa học với tác nhân khử là dịch chiết lá cỏ hơi, sản phẩm có khả n ng ứng dụng nhƣ là một ch t có tính kháng khuẩn đối với một số vi sinh vật.
2.1.2 Nội dung nghiên cứu
Trích ly dịch chiết từ cây cỏ hơi. Thực nghiệm tổng hợp nano đồng.
Khảo sát các thông số và điều kiện của các quá trình chiết.
Khảo sát điều kiện tối ƣu của quá trình tổng hợp bằng phƣơng pháp luân phiên từng biến.
Sử dụng các phƣơng pháp phân tích hóa lý hiện đại nhƣ Uv-Vis, FT - IR, SEM, TEM, EDX, XRD để nhận danh, đánh giá các sản phẩm của quá trình.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn một số loại vi sinh vật
2.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.2.1 Nguyên liệu
Nguồn nguyên liệu là cây Cỏ hơi đƣợc hái ở huyện Hóc mơn, thành phố Hồ Chí Minh.
Mẫu vi sinh vật đƣợc hỗ trợ nghiên cứu (khuẩn Bacillus subtillis, khuẩn Staphylococcus aureus).
31
2.2.2 Thiết bị
Bảng 2.1 Dụng cụ và thiết ị nghiên cứu
2.2.3 Hóa chất
- Hóa ch t dùng trong nghiên cứu chiết dịch chủ yếu là H2O c t 2 lần.
- Hóa ch t dùng trong nghiên cứu chế tạo vật liệu gồm: CuSO4, NaOH, H2SO4, là các hóa ch t có độ tinh khiết > 99%, nguồn gốc từ hãng Merck (Đức).
STT Dụng cụ STT Dụng cụ
1 Máy khu y từ gia nhiệt 8 Phễu chiết
2 Cân điện tử 9 Buret
3 Tủ s y 10 Beacher
4 Máy UV VIS 11 Phểu thủy tinh
5 Curvet 12 Bóp cao su
6 Bình định mức 13 Đũa thủy tinh
32
2.3 Thực nghiệm
2.3.1 Chiết dịch từ lá Cỏ hơi
Hình 2.1 Quy trình chiết dịch từ lá Cỏ hơi
Cây cỏ hôi tƣơi ỏ thân l y lá, sau đó rửa sạch với nƣớc và để ráo, cắt nhỏ nguyên liệu đến kích thƣớc khoảng 0.5 1cm nhằm dễ chiết dịch. Cân một lƣợng nh t định sau đó mang đi ngâm trong nƣớc theo các tỷ lệ nƣớc/lá cỏ khác nhau, gia nhiệt ở nhiệt độ nh t định trong một khoảng thời gian xác định ta thu đƣợc dịch chiết. Lọc và loại bỏ tạp ch t. Dịch lọc đƣợc ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 30 phút để loại bỏ cặn. Dịch trong sau ly tâm đƣợc lọc l y dịch lọc bằng gi y Whatman để loại bỏ phần cặn nhỏ cịn sót lại. Dịch chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ nhỏ hơn 10 oC để hạn chế q trình oxy hóa của dịch khử. T t cả dụng cụ đều đƣợc s y khô rửa bằng cồn 96 o [21] [22].
Dịch chiết thu đƣợc đƣợc pha loãng, tiến hành đo độ h p thu bằng phƣơng pháp Uv- Vis nhằm xác định cƣờng độ h p thu của dịch chiết. Từ đó có thể dự đốn đƣợc điều kiện tối ƣu cho quá trình chiết dịch.
Dịch chiết Nƣớc Làm nguội Chiết Lọc Cây cỏ Rửa sạch, làm khô Cắt nhỏ Đo mật độ quang A
33
Hình 2.2 Dịch chiết Cỏ hơi q trình khảo sát điều kiện thời gian chiết
Một lƣợng dịch chiết nh t định đƣợc chiết ở những điều kiện khảo sát và dung dịch CuSO4 xác định đƣợc hòa trộn với nhau ằng máy khu y từ trong khoảng thời gian nh t định, để thực hiện phản ứng tạo hạt nano đồng. Dung dịch sau phản ứng sẽ đƣợc mang đi phân tích trên máy quét phổ UV-Vis nhằm xác định đỉnh h p thu cực đại, độ dịch chuyển của các đỉnh h p thu cực đại. Từ đó có thể dự đốn đƣợc điều kiện phù hợp nh t để thu đƣợc hạt nano đồng nhƣ mong muốn.
34
Bảng 2.2 Các yếu tố khảo sát trong quá trình chiết dịch
STT Tỷ lệ
Lá/nƣớc (g) Thời gian chiết (phút) Nhiệt độ chiết (
o C) 1 1:2 10 Phòng 2 1:4 20 40 3 1:6 30 50 4 1:8 40 60 5 1:10 50 70 6 1:15 60 80 7 1:20 90 90
2.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết dịch
Thay đổi thời gian chiết lần lƣợt là 10, 20, 30, 40, 50, 60 và 90 phút và cố định các thông số khác nhƣ nhiệt độ chiết 70 oC , tỷ lệ lá/nƣớc 1/4.
Dịch chiết sau khi đƣợc chiết một phần đƣợc đem pha loãng và tiến hành đo Uv-Vis từ đó dự đốn sơ ộ xem điều kiện nào sẽ thu đƣợc hàm lƣợng ch t khử nhiều nh t.
2.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Thay đổi nhiệt độ chiết lần lƣợt từ nhiệt độ phòng, 40, 50, 60, 70, 80 và 90 oC và cố định các thông số khác nhƣ thời gian chiết, tỷ lệ lá: nƣớc.
Chọn thời gian quá trình tách chiết cho phù hợp nh t từ quá trình khảo sát trên. Dịch chiết sau khi đƣợc chiết tiến hành đánh giá nhƣ thử nghiệm trên để có cơ sở lựa chọn yếu tố ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến dịch chiết.
2.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ lá/nước
Thay đổi tỷ lệ lá/nƣớc lần lƣợt từ 1/2, 1/4, 1/6, 1/8, 1/10, 1/15 và 1/20 và cố định các thông số khác nhƣ nhiệt độ chiết, thời gian chiết.
35
Chọn thời gian và nhiệt độ của quá trình tách chiết cho phù hợp nh t từ hai quá trình khảo sát trên.
Dịch chiết sau khi đƣợc chiết tiến hành đánh giá nhƣ thử nghiệm trên để có cơ sở lựa chọn yếu tố ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến dịch chiết.
2.3.2 Tổng hợp nano Đồng sử dụng tác nhân khử là dịch chiết lá Cỏ hôi
Hình 2.3 Quy trình tổng hợp nano đồng
Quá trình tổng hợp dung dịch keo đồng nano từ tiền ch t đồng sunphat đƣợc thực hiện với các ƣớc nhƣ sau: Đầu tiên, dung dịch muối đồng đƣợc pha từ CuSO4.5H2O trong nƣớc c t với nồng độ cho trƣớc trong cốc 100 ml. Dung dịch thu đƣợc có màu xanh lam đƣợc gia nhiệt trên máy khu y từ đến giá trị nhiệt độ phản ứng. Dung dịch ch t khử là dịch chiết từ lá cỏ hôi đƣợc cho từ từ vào hỗn hợp theo một tỷ lệ nh t định để thực hiện phản ứng. Theo tiến trình phản ứng dung dịch sẽ chuyển từ màu xanh lam sang xanh lá và cuối cùng là chuyển sang màu đỏ nâu. Tiếp đến, l y hỗn hợp ra khỏi máy khu y từ. Dung dịch keo đồng nano đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm xác định cƣờng độ h p thu, đỉnh h p thu cực đại và độ dịch chuyển của các đỉnh h p thu cực đại. Từ đó có thể dự đốn
CuSO4 Dịch Chiết Lá Cỏ Khu y Gia Nhiệt Làm Nguội Uv-vis
36
đƣợc khả n ng hình thành của nano đồng trong dung dịch sau quá trình tổng hợp, XRD đƣợc tiến hành để xác định c u trúc tinh thể của nano đồng thu đƣợc, SEM, TEM, đƣợc dùng để xác định hình thái, phân ố kích thƣớc hạt nano đồng trong dung dịch. Sự hiện diện của ch t bao bọc (capping agent) trên bề mặt của hạt nano đƣợc xác định bởi FT-IR. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự thay đổi kích thƣớc, hình dạng và sự phân bố hạt của nano đồng đƣợc khảo sát gồm: nồng độ CuSO4, nhiệt độ phản ứng, tỷ lệ thể tích Dịch chiết/CuSO4, thời gian phản ứng.
Hình 2.4 Cơ chế của phản ứng
2.3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch CuSO4 (M)
Dung dịch đồng sunphat đƣợc cho phản ứng với dịch chiết từ lá cỏ hơi có tỷ lệ thể tích dịch cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml) là 1/5, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 50 oC, trong thời gian 12 giờ, đƣợc khu y từ với tốc độ 400 vòng/phút, nồng độ CuSO4 đƣợc khảo sát từ (0,5.10-3 ÷ 10-1 M), để ống nghiệm ổn định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở nồng độ nào.
2.3.2.2 Khảo sát tỷ lệ thể tích dịch chiết cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml)
Dung dịch đồng sunphat đƣợc cho phản ứng với dịch chiết từ lá cỏ hơi có tỷ lệ thể tích dịch cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml) khác nhau (2:1; 1:2; 1:5; 1:10, 1:20, 1:50). Phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 50 oC, trong thời gian 60 phút, đƣợc khu y từ với tốc độ 400 vòng/phút, nồng độ CuSO4 đƣợc chọn từ thí nghiệm trƣớc, để ống nghiệm ổn
37
định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở tỷ lệ nào.
2.3.2.3 Khảo sát thời gian phản ứng trong q trình tổng hợp nano đồng
Tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ 50 oC, đƣợc khu y từ với tốc độ 400 vịng/phút, tỷ lệ thể tích dịch chiết cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml), nồng độ CuSO4 đƣợc chọn từ thí nghiệm trƣớc. Trong đó thay đổi thời gian phản ứng lần lƣợt là 10 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút và 24 giờ, để ống nghiệm ổn định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở thời gian nào.
2.3.2.4 Khảo sát nhiệt độ trong quá trình tổng hợp nano đồng
Tiến hành thí nghiệm ở tốc độ khu y từ 400 vịng/phút, tỷ lệ thể tích dịch chiết cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml), thời gian phản ứng, nồng độ CuSO4 đƣợc chọn từ các thí nghiệm trƣớc. Trong đó thay đổi nhiệt độ phản ứng lần lƣợt là nhiệt độ phòng, 40 oC, 50 oC, 60 oC, 70 oC, 80 oC và 90 oC, để ống nghiệm ổn định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở nhiệt độ nào.
2.3.3 Khảo sát hoạt tính sinh học của hạt nano đồng
Tiến hành khảo sát khả n ng kháng n m và khuẩn của hạt nano đồng vừa mới tổng hợp trên một số loại khuẩn và n m gây hại đến sức khỏa của con ngƣời cũng nhƣ đến thực vật mà nghiên cứu phổ biến trong nƣớc và thế giới [8] [15]. Cụ thể là các chủng vi sinh vật kiểm định Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis và Staphylococcus aureus.
Quá trình khảo sát khả n ng kháng khuẩn của hạt nano đồng đƣợc hỗ trợ thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hoá Học Các Hợp Ch t Thiên Nhiên, Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam.
38
2.3.3.1 Phân lập vi sinh vật
Phân lập là quá trình tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi c y các tế bào trên trong môi trƣờng dinh dƣỡng đặc trƣng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
Vi sinh vật hiếu khí
- Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha lỗng cho vào đ a pêtri có mơi trƣờng thích hợp.
- Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.
- Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đ a pêtri thứ 2 rồi đ a thứ 3.
- Đặt các đ a pêtri trên vào tủ m ở nhiệt độ thích hợp sau một thời gian nh t định tuỳ giống vi sinh vật ta sẽ nhận đƣợc các khuẩn lạc riêng rẽ.
Vi sinh vật kị khí
- Dùng mơi trƣờng đặc trong ống nghiệm đem chƣng cách thuỷ để loại bỏ khơng khí trong mơi trƣờng.
- Để nguội mơi trƣờng cịn 45-50 oC.
- Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống mơi trƣờng, đậy nút lại, lắc trịn quanh trục ống nghiệm.
- Rót nhanh mơi trƣờng ở ống nghiệm vào nắp dƣới của đ a pêtri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và mơi trƣờng khơng cịn khơng khí.
- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đ a petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp.
- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trƣờng, dùng que c y cắt cả khối môi trƣờng rồi c y vào mơi trƣờng lỏng thích hợp.
2.3.3.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của nano đồng
Phƣơng pháp khuếch tán trên đ a thạch, tiến hành 3 lần, l y kết quả trung bình: Điều kiện thí nghiệm:
Thể tích dung dịch thử nhỏ vào mỗi lỗ thạch (Đƣờng kính 8 mm): 100 l Thể tích mơi trƣờng đƣa vào mỗi đ a petri Đƣờng kính 8 mm): 24 ml
39
- Lớp dƣới ( khơng có chủng VSV): 14 ml Nồng độ chủng: 6x105 CFU/ml
Nhiệt độ và thời gian nuôi c y: Vi khuẩn: 37 oC/18 giờ, N m: 23 oC/18 giờ. Sơ đồ thí nghiệm Vị trí 1: Mẫu 1 Vị trí 2: Mẫu 2 Vị trí 3: Mẫu 3 Vị trí 4: Mẫu 4 Vị trí 5: Mẫu 5 Vị trí 6: Kháng sinh Vị trí 7: Nƣớc 2.4 Thiết bị phân tích
2.4.1 Phương pháp hấp thu hồng ngoại biến đổi Fourie (FT – IR)
FT – IR là một phƣơng pháp xác định nhanh và khá chính xác các nhóm chức có trong sản phẩm. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên lý: khi chiếu một chùm tia đơn sắc có ƣớc sóng nằm trong vùng hồng ngoại 400 – 4000 cm-1 qua ch t cần phân tích, thì một phần n ng lƣợng của tia sáng bị h p thu và giảm cƣờng độ tia tới. Sự h p thu tuân theo định luật Lambert Beer:
D = lg (Io/I) = k.C.d Trong đó:
D: Mật độ quang
Io, I: Cƣờng độ ánh sáng trƣớc và sau khi ra khỏi ch t phân tích C: Nồng độ ch t phân tích, mol/l
d: Độ dày của lớp ch t h p phụ, cm k: Hệ số h p phụ.
Phân tử h p thu n ng lƣợng sẽ thực hiện các dao động (xê dịch các hạt nhân nguyên tử xung quanh vị trí cân bằng), làm giảm độ dài liên kết các phân tử và các góc hố
1 6 2 7 5 3 1 4
40
trị sẽ thay đổi một cách tuần hoàn. Đƣờng cong biểu thị sự phụ thuộc độ truyền quang vào ƣớc sóng là phổ hồng ngoại của mẫu phân tích. Mỗi nhóm chức hoặc liên kết có một tần số đặc trƣng ằng các pic (peak) trên phổ hồng ngoại. Nhƣ vậy c n cứ vào các tần số đặc trƣng này có thể xác định đƣợc liên kết giữa các nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử, từ đó xác định đƣợc c u trúc đặc trƣng của ch t cần phân tích [23] [24] [25].
Thực nghiệm: Các sản phẩm đƣợc đo trên máy hồng ngoại FT – IR system, tại Đại học Công nghiệp Tp.HCM.
2.4.2 Kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Kỹ thuật hiển vi điện tử quét cho phép quan sát và đánh giá các đặc trƣng của các vật liệu vô cơ cũng nhƣ hữu cơ trong khoảng kích thƣớc từ nm tới µm. Tính thơng dụng của SEM bắt nguồn từ khả n ng thu nhận các ảnh ba chiều từ các bề mặt của các loại vật liệu khác nhau. Trong ảnh SEM, vùng đƣợc khảo sát và phân tích đƣợc chiếu xạ bởi chùm điện tử có kích thƣớc nhỏ. Tƣơng tác của chùm điện tử và mẫu tạo ra các loại tín hiệu: Secondary electron (SE), điện tử tán xạ ngƣợc (Backscattered electrons – BSE), các tia X đặc trƣng.
Các tín hiệu thu đƣợc từ các vùng phát xạ riêng (có thể tích khác nhau) trong mẫu và đƣợc dùng để đánh giá nhiều đặc trƣng của mẫu (hình thái học bề mặt, tinh thể học, thành phần,…). Hai loại tín hiệu điện tử đƣợc quan tâm nhiều nh t để tạo ảnh hiển vi điện tử quét là SE và BSE. Các điện tử thứ c p là những điện tử thoát ra từ bề mặt mẫu có n ng lƣợng th p (thƣờng < 50 eV). Hiệu su t phát xạ SE lớn vì một điện tử tới có thể phát ra nhiều SE. Khi điện tử có n ng lƣợng lớn tới mẫu, chúng sẽ lần lƣợt tƣơng tác với các nguyên tử trong mẫu. Nếu các điện tử trong nguyên tử của mẫu nhận đƣợc n ng lƣợng lớn hơn cơng thốt chúng sẽ phá vỡ liên kết và thốt ra ngồi. Số lƣợng các SE phát ra từ mẫu phụ thuộc vào nguyên tử số Z của các nguyên tố trong mẫu, n ng lƣợng của điện tử tới, cơng thốt các điện tử trong nguyên tử và hình dạng bề mặt của mẫu. Các điện tử tán xạ ngƣợc là những điện tử thu nhận đƣợc khi chùm điện tử đâm sâu vào mẫu trƣớc khi quay trở lại bề mặt mẫu và tán xạ ngƣợc [26].
41
Ảnh SEM đƣợc chụp bằng máy S 4800 tại Nanotechnology Lab, SHTP labs. 35