5. Ý ng ha thực tiễn của đề tài
1.11 Các biện pháp khống chế vi sinh vật trên thế giới và Việt Nam
1.11.3 Bức xạ (radiation)
Bức xạ tử ngoại (Ultraviolet radiation-UV) với ƣớc sóng 260 nm có hiệu ứng diệt khuẩn r t mạnh, tuy nhiên khơng có khả n ng xun qua thủy tinh, các màng bẩn, nƣớc và một số cơ ch t khác. Vì vậy UV chỉ dùng để diệt khuẩn trong một số trƣờng hợp, ví dụ diệt khuẩn khơng khí trong tủ c y, phịng ni c y hoặc bền ngoài một số vật thể. UV cũng có thể dùng để diệt khuẩn nƣớc, phải là một tầng nƣớc mỏng đi qua đèn UV để đủ sức diệt mầm bệnh và các vi sinh vật khác.. Bức xạ ion hóa (ionizing radiation) hay bức xạ điện ly có sức xuyên r t mạnh và đƣợc dùng r t tốt để diệt khuẩn. Tia gamma từ nguồn co alt 60 đƣợc dùng để diệt khuẩn nguội đối với ch t kháng sinh, kích tố (hormones), chỉ khâu vết thƣơng, các vật liệu y học bằng ch t dẻo (plastic) nhƣ ống tiêm... Tia gamma còn đƣợc diệt khuẩn và tiêu độc (pasteurize) đối với thịt và các thực phẩm khác. Bức xạ ion hóa có thể diệt các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm nhƣ Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni... [17].
1.11.4 Phương pháp hóa học
Có nhiều loại hóa ch t đƣợc dùng làm ch t kháng khuẩn, mỗi loại đều có những ƣu điểm và nhƣợc điểm riêng. Trƣớc khi chọn sử dụng hóa ch t nào phải hiểu rõ đặc tính của ch t đó. Trong trƣờng hợp pha r t lỗng và có mặt ch t hữu cơ thì ch t đó vẫn có thể tác dụng có hiệu quả lên các nhân tố truyền nhiễm (vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm, vi khuẩn kháng acid, nội bào tử của vi khuẩn, các loại n m và virus...), mặt khác lại phải khơng có hại đối với cơ thể ngƣời, khơng làm n mịn các vật phẩm nói chung. Trong thực tiễn, r t khó đạt đến tiêu chuẩn vừa có hiệu lực vừa ít độc đối với cơ thể. Một số hóa ch t tuy hiệu lực th p nhƣng vì khá vơ hại nên vẫn đƣợc sử dụng. Ch t kháng khuẩn phải ổn định khi bảo quản, khơng có mùi vị khó chịu, tan trong nƣớc và trong dầu để dễ xâm nhập vào vi sinh vật và phải có sức c ng ề mặt th p để xâm nhập đƣợc vào các khe trên bề mặt. Nếu giá không cao càng tốt.
Một v n đề nghiêm trọng là việc sử dụng quá mức Triclosan và các ch t diệt khuẩn (germicides) khác. Ch t kháng khuẩn (antibacterial) này hiện th y có mặt trong các
23
sản phẩm nhƣ ch t khử mùi (deodorant), nƣớc súc miệng, xà phòng, thớt cắt rau, đồ chơi trẻ em... Triclosan hầu nhƣ đang có mặt khắp nơi, hậu quả là đã xu t hiện các vi khuẩn kháng Triclosan. Vì vậy việc dùng quá mức các ch t kháng khuẩn có khả n ng sinh ra những hậu quả khó lƣờng.
Bảng 1.3 Một số loại hóa ch t thƣờng đƣợc sử dụng làm ch t kháng khuẩn
Hóa chất Nồng độ sử dụng Mức độ hoạt tính
Ethylene oxide 450-500 mg/L Cao
Glutaraldehyde dịch thể 2 % Tƣơng đối cao
Formaldehyde + cồn 8 + 70 % Cao
H2O2 6-30 % Tƣơng đối cao
Formaldehyde dịch thể 6-8 % Tƣơng đối cao
Iodophors 750-5000 mg/L Tƣơng đối cao
Hợp ch t của Chlore 0,1-0,5 % Trung bình
Hợp ch t của
phenol,dịch thể 0,5-3 % Tƣơng đối th p
Cồn (ethyl, isopropyl) 70 % Trung bình
Hợp ch t Ammon bậc 4 0,1-0,2% trong nƣớc Th p
Chlorohexidine 0,75-4 % Th p
Hexachlorophene 1-3 % Th p
Hợp ch t Thủy ngân 0,1-0,2 % Th p
Hoạt tính cao-có thể làm chết vi khuẩn kể cả vi khuẩn lao, bào tử, n m, virus; Hoạt tính trung bình- làm chết mọi vi khuẩn, trừ bào tử; Hoạt tính th p- làm chết tế bào dinh dƣỡng của vi khuẩn, trừ VK lao, làm chết n m, virus có lƣợng lipid mức trung bình. Theo Symour S. Block, 1983.
Loại Phenol: là ch t kháng khuẩn đƣợc sử dụng rộng rãi đầu tiên. Hiện nay phenol
và các dẫn xu t nhƣ các loại cresol, các loại xylenol và orthophenylphenol đã đƣợc dùng để làm ch t kháng khuẩn trong các phịng thí nghiệm và bệnh viện. Chúng có ƣu điểm là có thể diệt vi khuẩn lao khi có mặt các ch t hữu cơ. Sau khi sử dụng có
24
thể duy trì tác dụng khá lâu trên bề mặt vật thể. Nhƣng chúng có mùi khó chịu và có thể làm kích thích da.
Cồn: là một trong những loại ch t kháng khuẩn thƣờng dùng. Cồn có thể làm chết
cả vi khuẩn và n m nhƣng không làm chết đƣợc bào tử. Một số virút chứa lipid cũng ị cồn làm chết. Ethanol và Isopopanol là hai loại cồn thƣờng dùng để diệt khuẩn, nồng độ thƣờng dùng là 70-80%, nồng độ này làm biến tính protein, cịn có thể làm hịa tan màng lipid.
Các Halogens: I và Cl là hai loại kháng vi sinh vật quan trọng. I thƣờng đƣợc dùng
làm thuốc phịng thối (antiseptic) ngồi da. Nó làm chết vi sinh vật do oxy hóa các thành phần tế bào, iod hóa (iodinating) các protein. Với nồng độ cao có thể làm chết bào tử, nói chung là sử dụng KI với nồng độ 2 % hay cao hơn iodine trong dung dịch nƣớc-ethanol. Mặc dầu I là ch t phịng thối có hiệu quả nhƣng cũng có thể làm tổn thƣơng da, có thể làm biến màu da, cịn có thể gây dị ứng (allergie).
Clo là một ch t tiêu độc tốt, khống đắt, lại dễ dàng sử dụng nên r t hay đƣợc sử dụng. Với một lƣợng nƣớc uống nhỏ có thể tiêu độc bằng những viên halozone. Halozone (acid parasulfone dichloramido enzoic) sau khi đƣa vào nƣớc sẽ từ từ giải phóng ra chloride, sau khoảng nửa giờ có thể đạt tới mục đích tiêu độc. Ch t này thƣờng đƣợc sử dụng trong trƣờng hợp thiếu nƣớc sạch để uống.
Dung dịch Cl là ch t tiêu độc có hiệu quả trong gia đình và trong các phịng thí nghiệm. Có thể dùng nồng độ pha lỗng 100 lần dịch tẩy trắng gia dụng (household bleach) phối hợp với ch t tẩy khơng ion hóa (non ionic detergent) sao cho nồng độ ch t tẩy vào khoảng 0,8%. Hỗn hợp này vừa làm sạch vừa loại bỏ vi khuẩn
Các Kim loại nặng: Trong nhiều n m các ion kim loại nặng nhƣ Hg, Ag, As, Zn và
Cu thƣờng đƣợc dùng để làm ch t diệt khuẩn (germicides). Nhiều kim loại nặng có tác dụng ức chế vi sinh vật (bacteriostatic) hơn là diệt khuẩn. Hiện các ch t này đã đƣợc thay thế bằng các ch t khác có độc tính th p hơn và có hiệu quả hơn. Nhƣng cũng có thƣờng hợp ngoại lệ, ví dụ dung dịch 1% AgNO3 thƣờng đƣợc dùng làm thuốc nhỏ mắt để phòng bệnh lậu ở mắt (trong nhiều bệnh viện ngƣời ta dùng Erythromycin để thay thế nitrat bạc vì ch t kháng sinh này có hiệu quả chống cả
25
Chlamydia lẫn Neisseria. Bạc sulfadiazine thƣờng đƣợc dùng trong điều trị bỏng. CuSO4 thƣờng đƣợc dùng để diệt tảo có hiệu quả trong ao hồ và các bể ơi. Kim loại nặng kết hợp với protein, làm b t hoạt protein và cũng có thể làm kết tủa protein của tế bào.
Hình 1.5 Kim loại kháng khuẩn Ag, Au
Các muối ammon bậc bốn: Các ch t tẩy (Detergents - từ gốc La Tinh detergere có
ngh a là loại trừ) là những phân tử hữu cơ đƣợc dùng làm các ch t giữ âm (wetting agents) và nhũ hóa (emulsifiers) vì chúng vừa có cực thân nƣớc (polar hydrophilic) vừa có những gốc phi cực kỵ nƣớc (nonpolar hydrophobic ends). Chúng có thể làm tan các ch t khó hịa tan bởi các phƣơng pháp khác, vì vậy dùng làm ch t tẩy rửa, giặt giũ r t có hiệu quả, nhƣng cơ chế khác với các ch t béo có trong xà phịng. Mặc dầu các ch t tẩy dạng ion có chức n ng kháng vi sinh vật nh t định nhƣng chỉ có các ch t tẩy rửa cationic (ion dƣơng) mới có tác dụng tiêu độc. Thƣờng dùng nh t là các muối ammon bậc bốn, chúng làm phá vỡ màng tế ào, cũng có thể làm biến tính protein.
Các Aldehyde: Hai loại aldehyde thƣờng đƣợc sử dụng là Formaldehyde và Glutaraldehyde. Chúng có phản ứng r t mạnh, có thể kết hợp với acid nucleic và protein và làm b t hoạt chúng, cịn có thể làm b t hoạt thông qua việc liên kết chéo (crosslinking) và alkyl hóa (alkylating). Chúng có thể làm chết bào tử, có thể dùng làm ch t diệt khuẩn hóa học. Formaldehyde thƣờng đƣợc dùng dƣới dạng hòa tan trong nƣớc hay trong cồn. Dung dịch đệm 2% glutaraldehyde là một loại ch t tiêu
26
độc có hiệu quả và thƣờng đƣợc dùng để tiêu độc các phịng thí nghiệm và bệnh viện. Glutaraldehyd trong 10 phút đã đủ để tiêu độc nhƣng để giết chết bào tử cần tới 12 giờ.
Các khí diệt khuẩn: Có nhiều vật phẩm khơng chịu đƣợc nhiệt độ cao nhƣ các đ a
Petri bằng ch t dẻo, các ống tiêm nhựa, các bộ phận của máy tim-phổi nhân tạo, các ống dẫn, ống nói... cần diệt khuẩn bằng khío ethylene oxide (EtO). EtO có thể kết hợp với protein, có thể làm chết cả vi sinh vật lẫn bào tử. EtO nhanh chóng xuyên qua đƣợc các bao bì bằng ch t dẻo nên là một loại ch t tiêu độc đặc biệt hiệu quả. Tiêu độc bằng EtO r t giống với tiêu độc trong nồi cao áp. Cần khống chế nồng độc EtO, nhiệt độ và độ ẩm. Với EtO thuần khiết thƣờng dùng nồng độ 10-20% phối hợp với CO2 hay dichlorodifluorromethane. Với các vật dụng sạch cần xử lý ở 38°C trong 5-8 giờ, nếu ở 54°C cần xử lý trong 3-4 giờ. Nồng độ EtO là là 700mg/lít.Vì EtO có độc tính lớn cho nên sau khi tiêu độc cần thổi khí mạnh để loại trừ hết EtO đi.
1.12 Tổng quan về cây cỏ hôi
Cỏ hơi (Bớp bớp hay cịn gọi là ba bớp, lốp bốp, cỏ Lào, yến bạch, cỏ hôi, cỏ Việt Minh, cỏ Nhật, cây cộng sản, cây phân xanh), danh pháp hai phần: Chromolaena odorata là loài thực vật nhiệt đới bản địa ở vùng Caribê và Bắc Mỹ thuộc họ Cúc (Asteraceae). Chúng đã phát tán sang vùng nhiệt đới ở châu Á, Tây Phi và một phần Úc. Đây là một loài cây bụi, có nhiều thân chính và tỏa nhiều nhánh hoặc thân ở gần gốc, tạo thành các tầng. Bớp bớp thƣờng mọc ở những nơi bãi hoang, thảo nguyên, bìa rừng [8] [18] [19].
Ở tuổi trƣởng thành, cây thƣờng cao từ 0,5 m đến 1,5 m. Tuổi thọ của cây khoảng từ 1 – 2,5 n m. Loài này ƣa sáng, chịu đựng tốt trong điều kiện khí hậu hanh khô. Bớp bớp nằm trong diện quan trọng của thảm thực vật. Sau khi xu t hiện, loài thực vật này nhanh chóng lan rộng ở Việt Nam, đƣợc ghi nhận n m 1935 cùng lúc với sự xu t hiện của phong trào cộng sản nên còn đƣợc gọi là cây cộng sản. Bớp bớp có thể đƣợc sử dụng làm dƣợc liệu, dùng cho cầm máu tốt, trong chiến tranh đƣợc các chiến s dùng trong quân y.
27
Hình 1.6 Cây Cỏ hơi
Những nghiên cứu cho th y cỏ lào chứa tinh dầu (có nhiều trong lá tƣơi), tanin (thuộc nhóm tanin pyrogalic), flavonoid (flavonol, flavanol, chalcol, dihydroflavonol), coumarin, ankaloit (có nhiều ở rễ), antraquinon, glucoxit.
1.13 Các phƣơng pháp chiết dịch từ thực vật Phƣơng pháp ngâm Phƣơng pháp ngâm
Tiến hành: sau khi chuẩn bị nguyên liệu, ngƣời ta rót dung mơi cho ngập nguyên liệu trong bình chiết. Sau một thời gian ngâm nh t định, rút l y dịch chiết (lọc và gạn) và rửa nguyên liệu bằng một dung mơi thích hợp. Có thể khu y trộn bằng cánh khu y hoặc hồn lƣu dịch chiết. Có nhiều cách ngâm: ngâm t nh hoặc ngâm động, nóng hoặc lạnh, một lần hoặc nhiều lần.
- Ƣu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết ị đơn giản, rẻ tiền.
- Nhƣợc điểm: n ng su t th p, thủ cơng. Chiết 1 lần thì khơng chiết kiệt đƣợc thành phần, chiết nhiều lần thì dịch chiết lỗng, tốn dung mơi, thời gian.
Phƣơng pháp ngấm kiệt
Tiến hành: sau khi chuẩn bị nguyên liệu, ngâm nguyên liệu vào dung mơi trong bình ng m kiệt. Sau một thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dƣới,
28
đồng thời bổ sung thêm dung mơi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy r t chậm và liên tục qua lớp nguyên liệu nằm yên. Dung môi thƣờng ngập bề mặt khoảng 3 - 4 cm. Ng m kiệt đơn giản: luôn sử dụng dung môi mới chiết để kiệt. Ng m kiệt phân đoạn: sử dụng dịch chiết loãng để chiết mẻ mới hoặc để chiết các mẻ có mức độ chiết kiệt khác nhau.
- Ƣu điểm: nguyên liệu đƣợc chiết kiệt, tiết kiệm đƣợc dung môi
- Nhƣợc điểm: n ng su t th p, thủ công, phức tạp hơn phƣơng pháp ngâm
Phƣơng pháp chiết xuất bán liên tục
Phƣơng pháp này sử dụng một hệ thống gồm nhiều bình chiết khác nhau, có thể mắc thành một dãy từ 4 – 16 bình chiết nối tiếp nhau (coi ngƣợc chiều là tƣơng đối vì dịch chiết khơng chuyển động).
Tiến hành: nguyên liệu và dung môi đƣợc nạp vào trong t t cả các thiết bị, nguyên liệu đƣợc ngâm trong dung mơi trong khoảng thời gian xác định. Sau đó dịch chiết đƣợc chuyển tuần tự từ thiết bị này qua thiết bị khác. Hệ thống tổ hợp kín này cho phép đóng ngắt một cách có chu kỳ thiết bị ra khỏi hệ thơng, cho phép tháo bã và nạp nguyên liệu mới. Sau đó thiết thiết bị này lại đƣợc đƣa vào hệ thống và dịch chiết đậm đặc nh t đƣợc qua nó và các thiết bị cón lại. Tiếp theo đóng ngắt một thiết bị kế tiếp, càng nhiều thiết bị thì quá trình càng gần quá trình liên tục. Q trình xảy ra theo ngun tắc: dung mơi mới tiếp xúc với nguyên liệu cũ và nguyên liệu mới tiếp xúc với dung môi cũ [4] [14] [20] [21] [22].
- Ƣu điểm: dịch chiết đậm đặc, nguyên liệu đƣợc vắt kiệt.
- Nhƣợc điểm: hệ thống cồng kềnh chiếm nhiều diện tích. Vận hành phức tạp, thao tác thủ cơng, khơng tự động hóa đƣợc.
Phƣơng pháp chiết xuất liên tục
Tiến hành: đƣợc tiến hành trong những thiết bị làm việc liên tục, nguyên liệu và dung môi liên tục đƣợc đƣa vào chuyển động ngƣợc chiều trong thiết bị. Nguyên liệu di chuyển nhờ cơ c u vận chuyển chuyên dụng khác nhau. Dịch chiết trƣơc khi
29
tiếp xúc với nguyên liệu mới nên dịch chiết thu đƣợc đậm đặc. Bã nguyên liệu đƣợc tiếp xúc với dung môi mới trƣớc khi thay nên đƣợc chiết kiệt. [4] [14] [20] [21] [22]
- Ƣu điểm: N ng su t cao, tiết kiệm thời gian, khơng phải làm thủ cơng có thể tự đơng hóa, cơ giới hóa. Dịch chiết đệm đặc, nguyên liệu đƣợc chiết kiệt, dung mơi ít tốn kém.
30
CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu
Tổng hợp nano đồng từ CuSO4 bằng phƣơng pháp khử hóa học với tác nhân khử là dịch chiết lá cỏ hơi, sản phẩm có khả n ng ứng dụng nhƣ là một ch t có tính kháng khuẩn đối với một số vi sinh vật.
2.1.2 Nội dung nghiên cứu
Trích ly dịch chiết từ cây cỏ hôi. Thực nghiệm tổng hợp nano đồng.
Khảo sát các thông số và điều kiện của các quá trình chiết.
Khảo sát điều kiện tối ƣu của quá trình tổng hợp bằng phƣơng pháp luân phiên từng biến.
Sử dụng các phƣơng pháp phân tích hóa lý hiện đại nhƣ Uv-Vis, FT - IR, SEM, TEM, EDX, XRD để nhận danh, đánh giá các sản phẩm của quá trình.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn một số loại vi sinh vật
2.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.2.1 Nguyên liệu
Nguồn nguyên liệu là cây Cỏ hôi đƣợc hái ở huyện Hóc mơn, thành phố Hồ Chí Minh.
Mẫu vi sinh vật đƣợc hỗ trợ nghiên cứu (khuẩn Bacillus subtillis, khuẩn Staphylococcus aureus).
31
2.2.2 Thiết bị
Bảng 2.1 Dụng cụ và thiết ị nghiên cứu
2.2.3 Hóa chất
- Hóa ch t dùng trong nghiên cứu chiết dịch chủ yếu là H2O c t 2 lần.
- Hóa ch t dùng trong nghiên cứu chế tạo vật liệu gồm: CuSO4, NaOH, H2SO4, là các hóa ch t có độ tinh khiết > 99%, nguồn gốc từ hãng Merck (Đức).
STT Dụng cụ STT Dụng cụ
1 Máy khu y từ gia nhiệt 8 Phễu chiết
2 Cân điện tử 9 Buret
3 Tủ s y 10 Beacher
4 Máy UV VIS 11 Phểu thủy tinh
5 Curvet 12 Bóp cao su
6 Bình định mức 13 Đũa thủy tinh
32
2.3 Thực nghiệm
2.3.1 Chiết dịch từ lá Cỏ hôi