Các muối ammon bậc bốn: Các ch t tẩy (Detergents - từ gốc La Tinh detergere có
ngh a là loại trừ) là những phân tử hữu cơ đƣợc dùng làm các ch t giữ âm (wetting agents) và nhũ hóa (emulsifiers) vì chúng vừa có cực thân nƣớc (polar hydrophilic) vừa có những gốc phi cực kỵ nƣớc (nonpolar hydrophobic ends). Chúng có thể làm tan các ch t khó hịa tan bởi các phƣơng pháp khác, vì vậy dùng làm ch t tẩy rửa, giặt giũ r t có hiệu quả, nhƣng cơ chế khác với các ch t béo có trong xà phịng. Mặc dầu các ch t tẩy dạng ion có chức n ng kháng vi sinh vật nh t định nhƣng chỉ có các ch t tẩy rửa cationic (ion dƣơng) mới có tác dụng tiêu độc. Thƣờng dùng nh t là các muối ammon bậc bốn, chúng làm phá vỡ màng tế ào, cũng có thể làm biến tính protein.
Các Aldehyde: Hai loại aldehyde thƣờng đƣợc sử dụng là Formaldehyde và Glutaraldehyde. Chúng có phản ứng r t mạnh, có thể kết hợp với acid nucleic và protein và làm b t hoạt chúng, cịn có thể làm b t hoạt thông qua việc liên kết chéo (crosslinking) và alkyl hóa (alkylating). Chúng có thể làm chết bào tử, có thể dùng làm ch t diệt khuẩn hóa học. Formaldehyde thƣờng đƣợc dùng dƣới dạng hòa tan trong nƣớc hay trong cồn. Dung dịch đệm 2% glutaraldehyde là một loại ch t tiêu
26
độc có hiệu quả và thƣờng đƣợc dùng để tiêu độc các phịng thí nghiệm và bệnh viện. Glutaraldehyd trong 10 phút đã đủ để tiêu độc nhƣng để giết chết bào tử cần tới 12 giờ.
Các khí diệt khuẩn: Có nhiều vật phẩm khơng chịu đƣợc nhiệt độ cao nhƣ các đ a
Petri bằng ch t dẻo, các ống tiêm nhựa, các bộ phận của máy tim-phổi nhân tạo, các ống dẫn, ống nói... cần diệt khuẩn bằng khío ethylene oxide (EtO). EtO có thể kết hợp với protein, có thể làm chết cả vi sinh vật lẫn bào tử. EtO nhanh chóng xun qua đƣợc các bao bì bằng ch t dẻo nên là một loại ch t tiêu độc đặc biệt hiệu quả. Tiêu độc bằng EtO r t giống với tiêu độc trong nồi cao áp. Cần khống chế nồng độc EtO, nhiệt độ và độ ẩm. Với EtO thuần khiết thƣờng dùng nồng độ 10-20% phối hợp với CO2 hay dichlorodifluorromethane. Với các vật dụng sạch cần xử lý ở 38°C trong 5-8 giờ, nếu ở 54°C cần xử lý trong 3-4 giờ. Nồng độ EtO là là 700mg/lít.Vì EtO có độc tính lớn cho nên sau khi tiêu độc cần thổi khí mạnh để loại trừ hết EtO đi.
1.12 Tổng quan về cây cỏ hôi
Cỏ hôi (Bớp bớp hay còn gọi là ba bớp, lốp bốp, cỏ Lào, yến bạch, cỏ hôi, cỏ Việt Minh, cỏ Nhật, cây cộng sản, cây phân xanh), danh pháp hai phần: Chromolaena odorata là loài thực vật nhiệt đới bản địa ở vùng Caribê và Bắc Mỹ thuộc họ Cúc (Asteraceae). Chúng đã phát tán sang vùng nhiệt đới ở châu Á, Tây Phi và một phần Úc. Đây là một loài cây bụi, có nhiều thân chính và tỏa nhiều nhánh hoặc thân ở gần gốc, tạo thành các tầng. Bớp bớp thƣờng mọc ở những nơi bãi hoang, thảo nguyên, bìa rừng [8] [18] [19].
Ở tuổi trƣởng thành, cây thƣờng cao từ 0,5 m đến 1,5 m. Tuổi thọ của cây khoảng từ 1 – 2,5 n m. Loài này ƣa sáng, chịu đựng tốt trong điều kiện khí hậu hanh khơ. Bớp bớp nằm trong diện quan trọng của thảm thực vật. Sau khi xu t hiện, lồi thực vật này nhanh chóng lan rộng ở Việt Nam, đƣợc ghi nhận n m 1935 cùng lúc với sự xu t hiện của phong trào cộng sản nên còn đƣợc gọi là cây cộng sản. Bớp bớp có thể đƣợc sử dụng làm dƣợc liệu, dùng cho cầm máu tốt, trong chiến tranh đƣợc các chiến s dùng trong quân y.
27
Hình 1.6 Cây Cỏ hơi
Những nghiên cứu cho th y cỏ lào chứa tinh dầu (có nhiều trong lá tƣơi), tanin (thuộc nhóm tanin pyrogalic), flavonoid (flavonol, flavanol, chalcol, dihydroflavonol), coumarin, ankaloit (có nhiều ở rễ), antraquinon, glucoxit.
1.13 Các phƣơng pháp chiết dịch từ thực vật Phƣơng pháp ngâm Phƣơng pháp ngâm
Tiến hành: sau khi chuẩn bị nguyên liệu, ngƣời ta rót dung mơi cho ngập nguyên liệu trong bình chiết. Sau một thời gian ngâm nh t định, rút l y dịch chiết (lọc và gạn) và rửa nguyên liệu bằng một dung mơi thích hợp. Có thể khu y trộn bằng cánh khu y hoặc hồn lƣu dịch chiết. Có nhiều cách ngâm: ngâm t nh hoặc ngâm động, nóng hoặc lạnh, một lần hoặc nhiều lần.
- Ƣu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, thiết ị đơn giản, rẻ tiền.
- Nhƣợc điểm: n ng su t th p, thủ cơng. Chiết 1 lần thì khơng chiết kiệt đƣợc thành phần, chiết nhiều lần thì dịch chiết lỗng, tốn dung mơi, thời gian.
Phƣơng pháp ngấm kiệt
Tiến hành: sau khi chuẩn bị nguyên liệu, ngâm nguyên liệu vào dung mơi trong bình ng m kiệt. Sau một thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dƣới,
28
đồng thời bổ sung thêm dung mơi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy r t chậm và liên tục qua lớp nguyên liệu nằm yên. Dung môi thƣờng ngập bề mặt khoảng 3 - 4 cm. Ng m kiệt đơn giản: luôn sử dụng dung môi mới chiết để kiệt. Ng m kiệt phân đoạn: sử dụng dịch chiết loãng để chiết mẻ mới hoặc để chiết các mẻ có mức độ chiết kiệt khác nhau.
- Ƣu điểm: nguyên liệu đƣợc chiết kiệt, tiết kiệm đƣợc dung môi
- Nhƣợc điểm: n ng su t th p, thủ công, phức tạp hơn phƣơng pháp ngâm
Phƣơng pháp chiết xuất bán liên tục
Phƣơng pháp này sử dụng một hệ thống gồm nhiều bình chiết khác nhau, có thể mắc thành một dãy từ 4 – 16 bình chiết nối tiếp nhau (coi ngƣợc chiều là tƣơng đối vì dịch chiết khơng chuyển động).
Tiến hành: nguyên liệu và dung môi đƣợc nạp vào trong t t cả các thiết bị, nguyên liệu đƣợc ngâm trong dung mơi trong khoảng thời gian xác định. Sau đó dịch chiết đƣợc chuyển tuần tự từ thiết bị này qua thiết bị khác. Hệ thống tổ hợp kín này cho phép đóng ngắt một cách có chu kỳ thiết bị ra khỏi hệ thông, cho phép tháo bã và nạp nguyên liệu mới. Sau đó thiết thiết bị này lại đƣợc đƣa vào hệ thống và dịch chiết đậm đặc nh t đƣợc qua nó và các thiết bị cón lại. Tiếp theo đóng ngắt một thiết bị kế tiếp, càng nhiều thiết bị thì quá trình càng gần quá trình liên tục. Quá trình xảy ra theo nguyên tắc: dung môi mới tiếp xúc với nguyên liệu cũ và nguyên liệu mới tiếp xúc với dung môi cũ [4] [14] [20] [21] [22].
- Ƣu điểm: dịch chiết đậm đặc, nguyên liệu đƣợc vắt kiệt.
- Nhƣợc điểm: hệ thống cồng kềnh chiếm nhiều diện tích. Vận hành phức tạp, thao tác thủ cơng, khơng tự động hóa đƣợc.
Phƣơng pháp chiết xuất liên tục
Tiến hành: đƣợc tiến hành trong những thiết bị làm việc liên tục, nguyên liệu và dung môi liên tục đƣợc đƣa vào chuyển động ngƣợc chiều trong thiết bị. Nguyên liệu di chuyển nhờ cơ c u vận chuyển chuyên dụng khác nhau. Dịch chiết trƣơc khi
29
tiếp xúc với nguyên liệu mới nên dịch chiết thu đƣợc đậm đặc. Bã nguyên liệu đƣợc tiếp xúc với dung môi mới trƣớc khi thay nên đƣợc chiết kiệt. [4] [14] [20] [21] [22]
- Ƣu điểm: N ng su t cao, tiết kiệm thời gian, khơng phải làm thủ cơng có thể tự đơng hóa, cơ giới hóa. Dịch chiết đệm đặc, nguyên liệu đƣợc chiết kiệt, dung mơi ít tốn kém.
30
CHƢƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu
Tổng hợp nano đồng từ CuSO4 bằng phƣơng pháp khử hóa học với tác nhân khử là dịch chiết lá cỏ hơi, sản phẩm có khả n ng ứng dụng nhƣ là một ch t có tính kháng khuẩn đối với một số vi sinh vật.
2.1.2 Nội dung nghiên cứu
Trích ly dịch chiết từ cây cỏ hôi. Thực nghiệm tổng hợp nano đồng.
Khảo sát các thông số và điều kiện của các quá trình chiết.
Khảo sát điều kiện tối ƣu của quá trình tổng hợp bằng phƣơng pháp luân phiên từng biến.
Sử dụng các phƣơng pháp phân tích hóa lý hiện đại nhƣ Uv-Vis, FT - IR, SEM, TEM, EDX, XRD để nhận danh, đánh giá các sản phẩm của quá trình.
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn một số loại vi sinh vật
2.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
2.2.1 Nguyên liệu
Nguồn nguyên liệu là cây Cỏ hơi đƣợc hái ở huyện Hóc mơn, thành phố Hồ Chí Minh.
Mẫu vi sinh vật đƣợc hỗ trợ nghiên cứu (khuẩn Bacillus subtillis, khuẩn Staphylococcus aureus).
31
2.2.2 Thiết bị
Bảng 2.1 Dụng cụ và thiết ị nghiên cứu
2.2.3 Hóa chất
- Hóa ch t dùng trong nghiên cứu chiết dịch chủ yếu là H2O c t 2 lần.
- Hóa ch t dùng trong nghiên cứu chế tạo vật liệu gồm: CuSO4, NaOH, H2SO4, là các hóa ch t có độ tinh khiết > 99%, nguồn gốc từ hãng Merck (Đức).
STT Dụng cụ STT Dụng cụ
1 Máy khu y từ gia nhiệt 8 Phễu chiết
2 Cân điện tử 9 Buret
3 Tủ s y 10 Beacher
4 Máy UV VIS 11 Phểu thủy tinh
5 Curvet 12 Bóp cao su
6 Bình định mức 13 Đũa thủy tinh
32
2.3 Thực nghiệm
2.3.1 Chiết dịch từ lá Cỏ hơi
Hình 2.1 Quy trình chiết dịch từ lá Cỏ hơi
Cây cỏ hôi tƣơi ỏ thân l y lá, sau đó rửa sạch với nƣớc và để ráo, cắt nhỏ nguyên liệu đến kích thƣớc khoảng 0.5 1cm nhằm dễ chiết dịch. Cân một lƣợng nh t định sau đó mang đi ngâm trong nƣớc theo các tỷ lệ nƣớc/lá cỏ khác nhau, gia nhiệt ở nhiệt độ nh t định trong một khoảng thời gian xác định ta thu đƣợc dịch chiết. Lọc và loại bỏ tạp ch t. Dịch lọc đƣợc ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 30 phút để loại bỏ cặn. Dịch trong sau ly tâm đƣợc lọc l y dịch lọc bằng gi y Whatman để loại bỏ phần cặn nhỏ cịn sót lại. Dịch chiết đƣợc bảo quản ở nhiệt độ nhỏ hơn 10 oC để hạn chế q trình oxy hóa của dịch khử. T t cả dụng cụ đều đƣợc s y khô rửa bằng cồn 96 o [21] [22].
Dịch chiết thu đƣợc đƣợc pha loãng, tiến hành đo độ h p thu bằng phƣơng pháp Uv- Vis nhằm xác định cƣờng độ h p thu của dịch chiết. Từ đó có thể dự đốn đƣợc điều kiện tối ƣu cho quá trình chiết dịch.
Dịch chiết Nƣớc Làm nguội Chiết Lọc Cây cỏ Rửa sạch, làm khô Cắt nhỏ Đo mật độ quang A
33
Hình 2.2 Dịch chiết Cỏ hơi q trình khảo sát điều kiện thời gian chiết
Một lƣợng dịch chiết nh t định đƣợc chiết ở những điều kiện khảo sát và dung dịch CuSO4 xác định đƣợc hòa trộn với nhau ằng máy khu y từ trong khoảng thời gian nh t định, để thực hiện phản ứng tạo hạt nano đồng. Dung dịch sau phản ứng sẽ đƣợc mang đi phân tích trên máy quét phổ UV-Vis nhằm xác định đỉnh h p thu cực đại, độ dịch chuyển của các đỉnh h p thu cực đại. Từ đó có thể dự đốn đƣợc điều kiện phù hợp nh t để thu đƣợc hạt nano đồng nhƣ mong muốn.
34
Bảng 2.2 Các yếu tố khảo sát trong quá trình chiết dịch
STT Tỷ lệ
Lá/nƣớc (g) Thời gian chiết (phút) Nhiệt độ chiết (
o C) 1 1:2 10 Phòng 2 1:4 20 40 3 1:6 30 50 4 1:8 40 60 5 1:10 50 70 6 1:15 60 80 7 1:20 90 90
2.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết dịch
Thay đổi thời gian chiết lần lƣợt là 10, 20, 30, 40, 50, 60 và 90 phút và cố định các thông số khác nhƣ nhiệt độ chiết 70 oC , tỷ lệ lá/nƣớc 1/4.
Dịch chiết sau khi đƣợc chiết một phần đƣợc đem pha loãng và tiến hành đo Uv-Vis từ đó dự đốn sơ ộ xem điều kiện nào sẽ thu đƣợc hàm lƣợng ch t khử nhiều nh t.
2.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Thay đổi nhiệt độ chiết lần lƣợt từ nhiệt độ phòng, 40, 50, 60, 70, 80 và 90 oC và cố định các thông số khác nhƣ thời gian chiết, tỷ lệ lá: nƣớc.
Chọn thời gian quá trình tách chiết cho phù hợp nh t từ quá trình khảo sát trên. Dịch chiết sau khi đƣợc chiết tiến hành đánh giá nhƣ thử nghiệm trên để có cơ sở lựa chọn yếu tố ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến dịch chiết.
2.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ lá/nước
Thay đổi tỷ lệ lá/nƣớc lần lƣợt từ 1/2, 1/4, 1/6, 1/8, 1/10, 1/15 và 1/20 và cố định các thông số khác nhƣ nhiệt độ chiết, thời gian chiết.
35
Chọn thời gian và nhiệt độ của quá trình tách chiết cho phù hợp nh t từ hai quá trình khảo sát trên.
Dịch chiết sau khi đƣợc chiết tiến hành đánh giá nhƣ thử nghiệm trên để có cơ sở lựa chọn yếu tố ảnh hƣởng của nhiệt độ chiết đến dịch chiết.
2.3.2 Tổng hợp nano Đồng sử dụng tác nhân khử là dịch chiết lá Cỏ hơi
Hình 2.3 Quy trình tổng hợp nano đồng
Quá trình tổng hợp dung dịch keo đồng nano từ tiền ch t đồng sunphat đƣợc thực hiện với các ƣớc nhƣ sau: Đầu tiên, dung dịch muối đồng đƣợc pha từ CuSO4.5H2O trong nƣớc c t với nồng độ cho trƣớc trong cốc 100 ml. Dung dịch thu đƣợc có màu xanh lam đƣợc gia nhiệt trên máy khu y từ đến giá trị nhiệt độ phản ứng. Dung dịch ch t khử là dịch chiết từ lá cỏ hôi đƣợc cho từ từ vào hỗn hợp theo một tỷ lệ nh t định để thực hiện phản ứng. Theo tiến trình phản ứng dung dịch sẽ chuyển từ màu xanh lam sang xanh lá và cuối cùng là chuyển sang màu đỏ nâu. Tiếp đến, l y hỗn hợp ra khỏi máy khu y từ. Dung dịch keo đồng nano đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm xác định cƣờng độ h p thu, đỉnh h p thu cực đại và độ dịch chuyển của các đỉnh h p thu cực đại. Từ đó có thể dự đốn
CuSO4 Dịch Chiết Lá Cỏ Khu y Gia Nhiệt Làm Nguội Uv-vis
36
đƣợc khả n ng hình thành của nano đồng trong dung dịch sau quá trình tổng hợp, XRD đƣợc tiến hành để xác định c u trúc tinh thể của nano đồng thu đƣợc, SEM, TEM, đƣợc dùng để xác định hình thái, phân ố kích thƣớc hạt nano đồng trong dung dịch. Sự hiện diện của ch t bao bọc (capping agent) trên bề mặt của hạt nano đƣợc xác định bởi FT-IR. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự thay đổi kích thƣớc, hình dạng và sự phân bố hạt của nano đồng đƣợc khảo sát gồm: nồng độ CuSO4, nhiệt độ phản ứng, tỷ lệ thể tích Dịch chiết/CuSO4, thời gian phản ứng.
Hình 2.4 Cơ chế của phản ứng
2.3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch CuSO4 (M)
Dung dịch đồng sunphat đƣợc cho phản ứng với dịch chiết từ lá cỏ hơi có tỷ lệ thể tích dịch cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml) là 1/5, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 50 oC, trong thời gian 12 giờ, đƣợc khu y từ với tốc độ 400 vòng/phút, nồng độ CuSO4 đƣợc khảo sát từ (0,5.10-3 ÷ 10-1 M), để ống nghiệm ổn định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở nồng độ nào.
2.3.2.2 Khảo sát tỷ lệ thể tích dịch chiết cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml)
Dung dịch đồng sunphat đƣợc cho phản ứng với dịch chiết từ lá cỏ hơi có tỷ lệ thể tích dịch cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml) khác nhau (2:1; 1:2; 1:5; 1:10, 1:20, 1:50). Phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 50 oC, trong thời gian 60 phút, đƣợc khu y từ với tốc độ 400 vòng/phút, nồng độ CuSO4 đƣợc chọn từ thí nghiệm trƣớc, để ống nghiệm ổn
37
định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở tỷ lệ nào.
2.3.2.3 Khảo sát thời gian phản ứng trong quá trình tổng hợp nano đồng
Tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ 50 oC, đƣợc khu y từ với tốc độ 400 vòng/phút, tỷ lệ thể tích dịch chiết cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml), nồng độ CuSO4 đƣợc chọn từ thí nghiệm trƣớc. Trong đó thay đổi thời gian phản ứng lần lƣợt là 10 phút, 30 phút,