2.3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch CuSO4 (M)
Dung dịch đồng sunphat đƣợc cho phản ứng với dịch chiết từ lá cỏ hơi có tỷ lệ thể tích dịch cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml) là 1/5, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 50 oC, trong thời gian 12 giờ, đƣợc khu y từ với tốc độ 400 vòng/phút, nồng độ CuSO4 đƣợc khảo sát từ (0,5.10-3 ÷ 10-1 M), để ống nghiệm ổn định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở nồng độ nào.
2.3.2.2 Khảo sát tỷ lệ thể tích dịch chiết cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml)
Dung dịch đồng sunphat đƣợc cho phản ứng với dịch chiết từ lá cỏ hơi có tỷ lệ thể tích dịch cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml) khác nhau (2:1; 1:2; 1:5; 1:10, 1:20, 1:50). Phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 50 oC, trong thời gian 60 phút, đƣợc khu y từ với tốc độ 400 vòng/phút, nồng độ CuSO4 đƣợc chọn từ thí nghiệm trƣớc, để ống nghiệm ổn
37
định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở tỷ lệ nào.
2.3.2.3 Khảo sát thời gian phản ứng trong quá trình tổng hợp nano đồng
Tiến hành thí nghiệm ở nhiệt độ 50 oC, đƣợc khu y từ với tốc độ 400 vòng/phút, tỷ lệ thể tích dịch chiết cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml), nồng độ CuSO4 đƣợc chọn từ thí nghiệm trƣớc. Trong đó thay đổi thời gian phản ứng lần lƣợt là 10 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 180 phút và 24 giờ, để ống nghiệm ổn định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở thời gian nào.
2.3.2.4 Khảo sát nhiệt độ trong q trình tổng hợp nano đồng
Tiến hành thí nghiệm ở tốc độ khu y từ 400 vòng/phút, tỷ lệ thể tích dịch chiết cỏ hơi (ml)/thể tích CuSO4 (ml), thời gian phản ứng, nồng độ CuSO4 đƣợc chọn từ các thí nghiệm trƣớc. Trong đó thay đổi nhiệt độ phản ứng lần lƣợt là nhiệt độ phòng, 40 oC, 50 oC, 60 oC, 70 oC, 80 oC và 90 oC, để ống nghiệm ổn định trong 24 giờ, tiến hành kiểm tra dung dịch keo đồng nano bằng phƣơng pháp phân tích UV-Vis nhằm đánh giá phản ứng xảy ra tốt nh t ở nhiệt độ nào.
2.3.3 Khảo sát hoạt tính sinh học của hạt nano đồng
Tiến hành khảo sát khả n ng kháng n m và khuẩn của hạt nano đồng vừa mới tổng hợp trên một số loại khuẩn và n m gây hại đến sức khỏa của con ngƣời cũng nhƣ đến thực vật mà nghiên cứu phổ biến trong nƣớc và thế giới [8] [15]. Cụ thể là các chủng vi sinh vật kiểm định Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis và Staphylococcus aureus.
Quá trình khảo sát khả n ng kháng khuẩn của hạt nano đồng đƣợc hỗ trợ thực hiện tại Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hoá Học Các Hợp Ch t Thiên Nhiên, Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam.
38
2.3.3.1 Phân lập vi sinh vật
Phân lập là quá trình tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi c y các tế bào trên trong môi trƣờng dinh dƣỡng đặc trƣng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
Vi sinh vật hiếu khí
- Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha lỗng cho vào đ a pêtri có mơi trƣờng thích hợp.
- Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.
- Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đ a pêtri thứ 2 rồi đ a thứ 3.
- Đặt các đ a pêtri trên vào tủ m ở nhiệt độ thích hợp sau một thời gian nh t định tuỳ giống vi sinh vật ta sẽ nhận đƣợc các khuẩn lạc riêng rẽ.
Vi sinh vật kị khí
- Dùng môi trƣờng đặc trong ống nghiệm đem chƣng cách thuỷ để loại bỏ khơng khí trong mơi trƣờng.
- Để nguội mơi trƣờng cịn 45-50 oC.
- Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống mơi trƣờng, đậy nút lại, lắc trịn quanh trục ống nghiệm.
- Rót nhanh mơi trƣờng ở ống nghiệm vào nắp dƣới của đ a pêtri và đậy thật nhanh nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và mơi trƣờng khơng cịn khơng khí.
- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đ a petri và ủ ở nhiệt độ thích hợp.
- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trƣờng, dùng que c y cắt cả khối mơi trƣờng rồi c y vào mơi trƣờng lỏng thích hợp.
2.3.3.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của nano đồng
Phƣơng pháp khuếch tán trên đ a thạch, tiến hành 3 lần, l y kết quả trung bình: Điều kiện thí nghiệm:
Thể tích dung dịch thử nhỏ vào mỗi lỗ thạch (Đƣờng kính 8 mm): 100 l Thể tích mơi trƣờng đƣa vào mỗi đ a petri Đƣờng kính 8 mm): 24 ml
39
- Lớp dƣới ( khơng có chủng VSV): 14 ml Nồng độ chủng: 6x105 CFU/ml
Nhiệt độ và thời gian nuôi c y: Vi khuẩn: 37 oC/18 giờ, N m: 23 oC/18 giờ. Sơ đồ thí nghiệm Vị trí 1: Mẫu 1 Vị trí 2: Mẫu 2 Vị trí 3: Mẫu 3 Vị trí 4: Mẫu 4 Vị trí 5: Mẫu 5 Vị trí 6: Kháng sinh Vị trí 7: Nƣớc 2.4 Thiết bị phân tích
2.4.1 Phương pháp hấp thu hồng ngoại biến đổi Fourie (FT – IR)
FT – IR là một phƣơng pháp xác định nhanh và khá chính xác các nhóm chức có trong sản phẩm. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên lý: khi chiếu một chùm tia đơn sắc có ƣớc sóng nằm trong vùng hồng ngoại 400 – 4000 cm-1 qua ch t cần phân tích, thì một phần n ng lƣợng của tia sáng bị h p thu và giảm cƣờng độ tia tới. Sự h p thu tuân theo định luật Lambert Beer:
D = lg (Io/I) = k.C.d Trong đó:
D: Mật độ quang
Io, I: Cƣờng độ ánh sáng trƣớc và sau khi ra khỏi ch t phân tích C: Nồng độ ch t phân tích, mol/l
d: Độ dày của lớp ch t h p phụ, cm k: Hệ số h p phụ.
Phân tử h p thu n ng lƣợng sẽ thực hiện các dao động (xê dịch các hạt nhân nguyên tử xung quanh vị trí cân bằng), làm giảm độ dài liên kết các phân tử và các góc hố
1 6 2 7 5 3 1 4
40
trị sẽ thay đổi một cách tuần hoàn. Đƣờng cong biểu thị sự phụ thuộc độ truyền quang vào ƣớc sóng là phổ hồng ngoại của mẫu phân tích. Mỗi nhóm chức hoặc liên kết có một tần số đặc trƣng ằng các pic (peak) trên phổ hồng ngoại. Nhƣ vậy c n cứ vào các tần số đặc trƣng này có thể xác định đƣợc liên kết giữa các nguyên tử hoặc nhóm nguyên tử, từ đó xác định đƣợc c u trúc đặc trƣng của ch t cần phân tích [23] [24] [25].
Thực nghiệm: Các sản phẩm đƣợc đo trên máy hồng ngoại FT – IR system, tại Đại học Cơng nghiệp Tp.HCM.
2.4.2 Kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Kỹ thuật hiển vi điện tử quét cho phép quan sát và đánh giá các đặc trƣng của các vật liệu vô cơ cũng nhƣ hữu cơ trong khoảng kích thƣớc từ nm tới µm. Tính thơng dụng của SEM bắt nguồn từ khả n ng thu nhận các ảnh ba chiều từ các bề mặt của các loại vật liệu khác nhau. Trong ảnh SEM, vùng đƣợc khảo sát và phân tích đƣợc chiếu xạ bởi chùm điện tử có kích thƣớc nhỏ. Tƣơng tác của chùm điện tử và mẫu tạo ra các loại tín hiệu: Secondary electron (SE), điện tử tán xạ ngƣợc (Backscattered electrons – BSE), các tia X đặc trƣng.
Các tín hiệu thu đƣợc từ các vùng phát xạ riêng (có thể tích khác nhau) trong mẫu và đƣợc dùng để đánh giá nhiều đặc trƣng của mẫu (hình thái học bề mặt, tinh thể học, thành phần,…). Hai loại tín hiệu điện tử đƣợc quan tâm nhiều nh t để tạo ảnh hiển vi điện tử quét là SE và BSE. Các điện tử thứ c p là những điện tử thoát ra từ bề mặt mẫu có n ng lƣợng th p (thƣờng < 50 eV). Hiệu su t phát xạ SE lớn vì một điện tử tới có thể phát ra nhiều SE. Khi điện tử có n ng lƣợng lớn tới mẫu, chúng sẽ lần lƣợt tƣơng tác với các nguyên tử trong mẫu. Nếu các điện tử trong nguyên tử của mẫu nhận đƣợc n ng lƣợng lớn hơn cơng thốt chúng sẽ phá vỡ liên kết và thốt ra ngồi. Số lƣợng các SE phát ra từ mẫu phụ thuộc vào nguyên tử số Z của các nguyên tố trong mẫu, n ng lƣợng của điện tử tới, cơng thốt các điện tử trong ngun tử và hình dạng bề mặt của mẫu. Các điện tử tán xạ ngƣợc là những điện tử thu nhận đƣợc khi chùm điện tử đâm sâu vào mẫu trƣớc khi quay trở lại bề mặt mẫu và tán xạ ngƣợc [26].
41
Ảnh SEM đƣợc chụp bằng máy S 4800 tại Nanotechnology Lab, SHTP labs. 35 Nguyễn Thông, Quận 3, thành phố Hồ Chí Minh.
2.4.3 Nhiễu xạ tia X (XRD)
Phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (XRD) dựa trên hiện tƣợng nhiễu xạ tia X của các vật liệu kết tinh. Khi chiếu chùm tia X có ƣớc sóng và mạng tinh thể của vật liệu, các họ mặt phẳng mạng tinh thể của vật liệu, các họ mặt phẳng (hkl) có giá trị dhkl thỏa mãn điều kiện phản xạ Bragg: 2dhklsin2θ =n. sẽ cho các cực đại nhiễu xạ tại vị trí góc nhiễu xạ θ = arcsin(n/2dhkl) tƣơng ứng trên giản đồ nhiễu xạ n nhận các giá trị 1,2,3... gọi là bậc nhiễu xạ. Thông thƣờng chỉ quan sát đƣợc các nhiễu xạ bậc 1 (n=1). Những đặc trƣng quan trọng nh t của các giản đồ nhiễu xạ tia X là vị trí của các vạch nhiễu xạ, cƣờng độ vạch nhiễu xạ và đƣờng cong phân bố của vạch nhiễu xạ đó. Phƣơng pháp này cho phép xác định pha c u trúc, phân tích định tính, định lƣợng các pha tinh thể, hằng số mạng, mức độ biến dạng mạng, so sánh xác định tƣơng đối hàm lƣợng pha tạp, từ đó cho phép điều chỉnh quy trình cơng nghệ chế tạo vật liệu và góp phần lý giải các hiện tƣợng vật lý.
Phân tích nhiễu xạ tia X (XRD) đƣợc thực hiện trên thiết bị D8-Advance, Bruker, Germany tại Nanotechnology Lab, SHTP labs. 35 Nguyễn Thông, Quận 3, thành phố Hồ Chí Minh [23] [24] [25].
2.4.4 Hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Hiển vi điện tử truyền qua - Transmission Electron Microscopy (TEM) là thiết bị hiệu quả nh t đối với những nghiên cứu về khoa học nano. TEM cho phép xác định hình thái c u trúc bên trong của vật liệu nano với độ phân giải có thể lên tới 0,1nm. Do đó, phƣơng pháp này cho phép xác định chính xác hình dạng và kích thƣớc các hạt nano đồng thu đƣợc [24].
Nguyên tắc của kính hiển vi điện tử truyền qua là do sự tán xạ của chùm electron xuyên qua mẫu. TEM đƣợc c u tạo bởi các chính gồm: hệ thống chiếu sáng, hệ thống th u kính và hệ thống phân tích ảnh [15]. Kích thƣớc và sự phân bố hạt đồng
42
nano đƣợc xác định từ ảnh TEM thực hiện trên máy JEM-1400, Nhật Bản tại Trƣờng Đại học Bách Khoa – TP. Hồ Chí Minh.
2.4.5 Phương pháp phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (UV-Vis)
Để xác định sơ ộ thành phần các nhóm chức có thể tồn tại trong dịch chiết, xác định số nối đơi liên hợp, ƣớc sóng cực đại, độ h p thu quang A, tính độ tận trích của dịch chiết lên vật liệu, thơng thƣờng xác định bằng cách kiểm tra quang phổ khả kiến- tử ngoại (UV-Vis) [24] [25].
Phƣơng pháp Uv-Vis này tuân thủ theo định luật Beer-Lambert có phƣơng trình nhƣ sau:
A = logI0/I= ε LC Trong đó:
Io và I: cƣờng độ của tia tới và tia phản xạ tƣơng ứng L: chiều dày của dung dịch h p thụ tính bằng cm C: nồng độ dung dịch tính bằng mol/l
ε: độ h p thụ phân tử gam và có thứ nguyên là 1000 cm2/mol, đây là tính ch t của phân tử tham gia ƣớc chuyển electron và không phải là hàm số của các thông số thay đổi khi chuẩn bị dung dịch.
A: độ h p thụ hay mật độ quang
Kết quả xác định UV-Vis đƣợc thực hiện trên thiết bị Evolution 600 UV-Vis Spectrophotometer tại phịng thí nghiệm trƣờng Đại học Công nghiệp Tp. Hồ Chí Minh.
2.4.6 Phương pháp phổ tán xạ năng lượng tia X (EDX)
Phổ tán xạ n ng lƣợng tia X (thƣờng đƣợc ký hiệu là EDX, EDS hoặc XEDS) là kỹ thuật phân tích thành phần hóa học của vật rắn dựa vào việc ghi lại phổ tia X phát ra từ vật rắn do tƣơng tác với chùm điện tử có n ng lƣợng cao.
Nguyên tắc của phƣơng pháp EDX là dựa trên sự tƣơng tác giữa nguồn tia X kích thích và mẫu cần phân tích. Mỗi ngun tố hố học có một thành phần nguyên tử xác định tạo ra các vạch phổ đặc trƣng cho nguyên tố đó. Để tạo bức xạ đặc trƣng từ
43
mẫu, một dòng n ng lƣợng cao của các hạt tích điện nhƣ điện tử, photon, hay chùm tia X đƣợc chiếu vào mẫu cần phân tích. Thơng thƣờng, các điện tử trong mẫu ở các trạng thái cơ ản (chƣa ị kích thích) và chúng xoay quanh hạt nhân ở các mức n ng lƣợng khác nhau. Khi kích thích bằng một chùm tia X, điện tử sẽ nhảy lên một mức n ng lƣợng cao hơn, tạo nên một lỗ trống điện tử, một điện tử khác từ lớp bên ngồi có n ng lƣợng cao hơn nhảy vào để điền vào lỗ trống đó. Bƣớc nhảy này giải phóng n ng lƣợng dƣới dạng n ng lƣợng tia X tán xạ.
Phân tích EDX đƣợc thực hiện tại Nanotechnology Lab, SHTP labs. 35 Nguyễn Thơng, Quận 3, thành phố Hồ Chí Minh [23] [24] [25].
2.4.7 Phương pháp sắc ký lỏng LC-MS
LC-MS là phƣơng pháp đƣợc dùng trong phân tích các hợp ch t cần nhận danh chính xác. Trong những điều kiện vận hành nh t định ngoài thời gian lƣu đặc trƣng, các ch t cịn đƣợc nhận danh bằng khối phổ của nó.
Nguyên lý chung: Phƣơng pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phƣơng pháp nghiên cứu các ch t bằng cách đo, phân tích chính xác khối lƣợng phân tử của ch t đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trƣờng hoặc từ trƣờng nh t định. Tỷ số giữa khối lƣợng và điện tích (m/z) có ảnh hƣởng r t lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biệt đƣợc điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định đƣợc khối lƣợng của ion đó.
Nhƣ vậy, trong nghiên cứu khối phổ của b t kỳ ch t nào, trƣớc tiên nó phải đƣợc chuyển sang trạng thái ay hơi, sau đó đƣợc ion hóa bằng các phƣơng pháp thích hợp. Các ion tạo thành đƣợc đƣa vào nghiên cứu trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà ngƣời ta chọn kiểu quét ion dƣơng (+) hoặc âm (-). Kiểu quét ion dƣơng thƣờng cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên đƣợc dùng phổ biến hơn.
Tuy nhiên, sự phát triển của lỹ thuật hiện nay cũng đã cho phép tích hợp hai kiểu quét này thành một nhằm tạo điều kiện thuận lợi nh t cho các nhà nghiên cứu, tuy nhiên thƣờng độ nhạy không cao bằng từng kiểu quét riêng lẻ.
44
Trong r t nhiều n m, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với r t nhiều khó khan trong việc tìm cách giải quyết đƣợc sự tƣơng thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dị MS địi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các ch t khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dịng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp su t cao với một lƣợng dung môi tƣơng đối lớn, nhiệt độ tƣơng đối th p, các ch t phân tích ở thể lỏng.
Phân tích LC-MS đƣợc thực hiện tại Đại học Khoa học tự nhiên, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh [23] [24] [25].
45
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Kết quả khảo sát q trình chiết dịch lá cỏ hơi
Dịch chiết thu đƣợc từ lá cỏ hôi với tỷ lệ lá/nƣớc khác nhau ở nhiệt độ 80 oC trong thời gian 60 phút đƣợc trình ày nhƣ hình 3.1. Ở tỷ lệ lá/nƣớc th p, dịch chiết có