4.1.1 Nhóm kháng sinh Cloramphenicol
ĐỊNH LƯỢNG CLORAMPHENICOL
TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG SẮC LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS
1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này hướng dẫn xác định hàm lượng cloramphenicol trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0.08ppb.
2. Nguyên tắc
Cloramphenicol được chiết tách từ mẫu thủy sản bằng etylacetat, cô dịch chiết bằng khí nitơ ở 50oC, cặn khô được hòa tan trong dung dịch acid acetic 0.05%, sau đó được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (SPE C18). Hàm lượng cloramphenicol được xác định bằng LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện là 0.08ppb.
3. Thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống sắc ký lỏng gồm: bơm và bộ tiêm mẫu tự động.
- Đầu dò MS (ThermoQuest Finnigan TSQ Quantum)
- Phần mềm điều khiển: Xcalibur Version 1.3.
- Cột LC: Waters brand Xterra C18 kích thước 2.1 x 150mm, kích thước hạt 3.5mm.
- Máy Vortex, máy lắc - Bộ thổi khí nitơ N – EVAP
- Cột SPE: C18 Varian Bond Elul 6cc/500mg
- Một số hóa chất sử dụng cho HPLC như: acetonitrile, ethyl acetate, ammonium hydroxide (NH3 30%), axit acetic.
- Màng lọc Acrodisc (đường kính màng 13mm, đường kính lỗ 0.45mm) 4. Hóa chất
- Chuẩn CAP
- Nội chuẩn m-CAP - Acetonitrile - Ethyl acetate - Khí nitơ - Hexan - Methnol - Nước
5. Dung dịch nội chuẩn
Dung dịch nội chuẩn sử dụng là meta – cloramphenicol (m – CAP).
5.1 Dung dịch nội chuẩn gốc m-CAP 100ppm: Cân 1 lượng tương đương 5mg nội chuẩn m-CAP bằng cân phân tích, chuyển vào bình định mức 50ml và định mức đến vạch bằng acetonitrile (ACN)
5.2 Dung dịch nội chuẩn trung gian 1ppm hay 1000ppb: Hút chính xác 0,1ml dung dịch nội chuẩn gốc (5.1) 100ppm vào bình định mức 10ml và định mức bằng ACN tới vạch.
5.3 Dung dịch nội chuẩn làm việc 20ppb: Hút chính xác 5ml dung dịch nội chuẩn trung gian (5.2) 1000ppb vào bình định mức 250ml và định mức tới vạch bằng nước. Mỗi 10g mẫu bổ sung thêm 150ml dung dịch nội chuẩn bổ sung 20ppb để được nội chuẩn có nồng độ là 0,3ppb.
6 Dung dịch chuẩn cloramphenicol
6.1 Dung dịch chuẩn gốc cloramphenicol 100ppm: Cân 1 lượng tương đương 5mg chuẩn CAP bằng cân phân tích, chuyển vào bình định mức 50ml và định mức đến vạch bằng acetonitrile (ACN)
6.2 Dung dịch chuẩn trung gian 1ppm hoặc 1000ppb: Hút chính xác 0,1ml dung dịch chuẩn gốc (6.1) 100ppm vào bình định mức 10ml và định mức bằng nước tới vạch.
6.3 Dung dịch chuẩn trung gian 100ppb: Hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn trung gian (6.2) 1000ppb cho vào bình định mức 10ml và định mức tới vạch bằng nước.
6.4 Dung dịch chuẩn làm việc 20ppb: Hút chính xác 5ml dung dịch chuẩn trung gian (6.3) 100ppb cho vào bình định mức 250ml và định mức tới vạch bằng nước.
7.1 Chuẩn bị mẫu thử: Bóc vỏ nguyên liệu (nếu có) cho vào máy xay mẫu và xay nhuyễn cho đến khi mẫu đồng nhất.
Cân chính xác 10g mẫu cho vào ống ly tâm polypropylene 50ml, thêm 150ml nội chuẩn m-CAP 20ppb.
7.2 Chuẩn bị mẫu trắng: Cân chính xác 10g mẫu cho vào ống ly tâm polypropylene 50ml, thêm 150ml nội chuẩn m-CAP 20ppb. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như mẫu thử. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7.3 Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn
Cân lần lượt 5 mẫu trắng có khối lượng 10g vào ống ly tâm 50ml, bổ sung dung dịch chuẩn và nội chuẩn như sau:
Bảng 4.1. Mối liên hệ giữa thể tích và nồng độ của chuẩn CAP và nội chuẩn m-CAP thêm vào để dựng đường chuẩn
Thể tích (ml) Nồng độ trong mẫu (ppb) CAP 20ppb m-CAP 20ppb CAP m-CAP
0 50 150 300 450 150 150 150 150 150 0 0.1 0.3 0.6 0.9 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
7.4 Cho thêm 20ml hỗn hợp (EtOAC:NH4OH, 98:2) đồng nhất bằng cách vortex cho đến khi toàn bộ khối mẫu rời ra (khoảng 30 giây). Trộn đều trên máy Multitube Vortex trong 10 phút.
7.5 Ly tâm 7 phút ở tốc độ 4000 rpm, chuyển phần dung dịch vào ống ly tâm PP 50ml khác. Thổi khí nitơ ở nhiệt độ 50oC.
7.6 Lặp lại quá trình ly trích theo bước 7.4 và 7.5 hai lần 7.7 Làm khô hoàn toàn dịch chiết bằng khí nitơ.
7.8 Thêm 30ml acid acetic 0.05% trong nước cho vào dịch trích đã được
làm khô, vortex khoảng 5 phút.
7.9 Thêm 10ml hexan vào ống 50ml và đậy nắp lại. Vortex. Ly tâm 3 phút ở 4000 rpm. Dùng ống hút pipet để loại phần hexan trên mặt. Lặp lại bước khử béo trên 2 lần với mỗi lần 5ml hexan và cuối cùng hút bỏ hết phần chất lỏng trên mặt phân cách giữa hexan và nước.
7.10 Hoạt hóa cột SPE C18 bằng 3ml metanol và 3ml nước. Chuyển phần dung dịch sau ly trích vào hệ thống cột SPE, tốc độ chảy khoảng 1 giọt/giây.
7.11 Rửa giải cột với 2ml nước, giải hấp bằng 2ml MeOH vào trong ống ly tâm 15ml. Làm bay hơi MeOH bằng khí nitơ.
7.12 Hỗn hợp ly trích sau khi làm khô được hòa tan lại bằng 0.5ml nước, vortex 5 phút để hòa tan phần còn lại và dùng ổng tiêm lọc qua màng lọc Acrodisc, cho vào vial để phân tích trên LC-MS.
8 Thông số chạy máy Pha động A: Nước Pha động B: Acetonitrile Gradient Program
Bảng 4.2. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích CAP No. Time, min Flow, ml/min A, % B, %
1 0.00 200 65 35 2 6.00 200 65 35 3 6.50 200 10 90 4 13.50 200 10 90 5 14.00 200 65 35 6 20.00 200 65 35 Source: ESI Spay voltage: 1500V
Sheath gas pressure: 29 Aux gas pressure: 18 Capillary temperature: 350oC
Tube lens offset: 70
Collision pressure (argon): 1.5torr
Wash Bottle: metanol
Injection volume (ml): 75.00 Flush volume (ml): 2000 Needle height from bottom (mm): 0.2 Wash volume (ml): 2000 Flush speed (ml/s): 250 Post – Injection Valve switch time (min): 0 Syringe speed (ml/s): 8 Tray temp control is on. Temp (oC): 5 Column oven control is on. Temp (oC): 30 Min. pressure, bar: 10
Max. pressure, bar: 400 Pumping Efficiency, %: 100 Fractionations/ Filling Stroke: 1 Use custom stability limits: No
9 Điều kiện phân mảnh MS/MS
Product ion m/z
CAP : 257, 152
m-CAP: 207
10 Tính toán kết quả
Hệ số tính hiệu của từng mẫu phân tích theo từng nồng độ chất chuẩn: X x C x W
RF = --- Y x V Trong đó: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- X là tỷ số trung bình diện tích pic (CAP/m-CAP) cho dung dịch mẫu thử.
- C là hàm lượng của CAP trong dung dịch các chuẩn, tính theo ng/g.
- W là khối lượng mẫu thử, tính theo g
- Y là tỷ số diện tích trung bình CAP/m-CAP trong dung dịch các chuẩn. - V là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử tính theo ml.
Dựng đồ thị hàm lượng CAP trong từng mẫu phân tích với nồng độ chất chuẩn bổ sung theo phương pháp hồi qui tuyến tính.
RF = ax + b
a: hệ số góc của đường chuẩn b: tung độ gốc của đường chuẩn
Tính hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu kiểm dựa theo hệ số tính hiệu của từng mẫu phân tích và đường chuẩn theo đơn vị ppb.
4.1.2 Nhóm kháng sinh Malachite Green và Leucomalachite Green
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LEUCOMALACHITE GREEN BẰNG SẮC KÝ LỎNG
GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS 1 Phạm vi áp dụng
Phương pháp này hướng dẫn việc xác định dư lượng Leucomalachite Green và Malachite Green trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1ppb.
2 Nguyên tắc
MG và LMG được trích bằng dung dịch đệm acetate và acetonitrile. Tiếp theo, dịch trích được chiết tách lại bằng methylene chloride. LMG sẽ bị oxi hóa trở về dạng MG bằng phản ứng với 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone. Mẫu phân tích được làm sạch hơn bằng sự chiết với pha rắn gồm alumina và propylsulfonic acid. Cuối cùng, dịch chiết được phân tích bằng LC với bước sóng phát hiện ở 618 nm.
3 Thiết bị, dụng cụ 3.1 Thiết bị
- Hệ thống LC-MS bao gồm: - LC 1100 Agilent
- MS với nguồn ESI hoặc APCI
- Phần mềm điều khiển Xcaliber ( Version 1.3)
- Máy đồng nhất mẫu - Máy ly tâm - Vortex 3.2 Dụng cụ - Ống ly tâm 50ml - Bình định mức - Pipettes - Bình quả lê 150ml - Bình chiết 250ml
- Cột chiết pha rắn SPE: Cột Alumina (ALN-SPE), Bakerbond alumina SPE, 6ml, 500mg, acid propylsulfonic (PRS-SPE),500mg.
- Vial 2ml và một số dụng cụ khác. 4 Hóa chất, thuốc thử 4.1 Hóa chất - Nước cất, HPLC - Methanol, HPLC - Acetonitrile, HPLC - Methylene chloride
4.2 Dung dịch, thuốc thử
4.2.1 Acid formic 0.1% (pha động cho LC-MS): Hút 1ml acid formic cho vào bình định mức 1000ml và định mức đến vạch bằng nước cất.
4.2.2 Dung dịch đệm acetate: hòa tan 7.7g ammonium acetate và 5ml p- toluene sulfonic acid (p-TSA) trong nước, đều chỉnh pH về 4.5 bằng acid acetic, thêm nước để được 1 lít.
4.2.3 Dung dịch 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone (DDQ): từ dung dịch chuẩn DDQ được pha loãng trong acetonitrile để được dung dịch làm việc DDQ 0.001M
4.2.4 Một số dung dịch khác - Diethylene glycol
- Alumina
- Hydroxyamine hydrochloride 0.25g/ml - Dung dịch p-TSA 1M trong nước.
4.2.5 Dung dịch chuẩn gốc Malachite Green (MG) 100ppm: Cân 10g chuẩn MG cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol.
4.2.6 Dung dịch chuẩn trung gian MG 1ppm: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc MG (4.2.5) 100ppm cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.2.7 Dung dịch chuẩn làm việc MG 100ppb: Hút 1ml dung dịch chuẩn trung gian MG (4.2.6) 1ppm cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol.
4.2.8 Dung dịch chuẩn gốc Leucomalachite Green (LMG) 100ppm: Cân 10g chuẩn LMG cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol.
4.2.9 Dung dịch chuẩn bố sung LMG 1ppm: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc LMG (4.2.8) 100ppm cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol.
4.2.10 Dung dịch chuẩn làm việc LMG 100ppb: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc LMG (4.2.9) 1ppm cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol.
5. Các bước chuẩn bị mẫu
Mẫu được đồng nhất trước khi tiến hành ly trích, bảo quản mẫu bằng nước đá khô hoặc trữ đông ở -20oC đến khi phân tích.
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
Cân 5g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml. 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Cân 5g mẫu không chứa MG và LMG cho vào ống ly tâm 50ml. 5.3 Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn
Chuẩn bị lần lượt 6 mẫu trắng mỗi mẫu 5g cho vào ống ly tâm 50ml và bổ sung dung dịch chuẩn làm việc MG 100ppb và dung dịch chuẩn làm việc LMG 100ppb để được dãy đường chuẩn có nồng độ lần lượt là 0, 1, 2, 4, 10 và 20ppb.
Bảng 4.3. Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm MG và LMG vào mẫu trắng để dựng đường chuẩn Thể tích (µl) Nồng độ trong mẫu (ppb) MG 100ppb LMG 100ppb MG LMG 0 0 0 0 50 50 1 1 100 100 2 2 200 200 4 4 500 500 10 10 1000 1000 20 20
Sau đó tiến hành ly trích mẫu qua các bước sau:
- Thêm vào các ống nhựa chứa mẫu 5ml dung dịch đệm acetate, 100ml dung dịch p-TSA 1M, 1ml hydroxyamine (0.25g/ml). Lắc đều.
- Thêm 25 ml acetonitrile, lắc 30 giây. Sau đó thêm tiếp 5 – 6g alumina và lắc tiếp 15 giây. Ly tâm 4000rpm ở 0oC. Chuyển dịch trong vào bình chiết thủy tinh 250 ml đã chứa sẵn 50 ml nước và 2 ml diethylene glycol.
- Thêm 25 ml acetonitrile vào ống chứa mẫu. Chuyển dịch trong vào cùng bình chiết thủy tinh 250 ml ở bước trên.
- Thêm 25 ml methylene chloride vào trong bình chiết. Lắc nhẹ và để yên cho tách lớp. Chuyển lớp methylene chloride (ở dưới) vào trong bình cầu quả lê 150 ml.
- Cô dịch trong bình cầu quả lê cho đến khô trên máy cô quay chân không.
- Hòa tan cặn khô bằng 3 ml ACN và 3ml DDQ 0.001M để oxi hóa LMG về dạng MG.
- Cho qua hệ thống chiết pha rắn với alumina và acid propylsulfonic với tốc độ 4ml/min.
- Rửa cột bằng acetonitrile và MG được rửa giải bằng 4ml dung dịch đệm acetonitrile: ammonium acetate (50:50) và định mức lên 5ml cho mỗi mẫu.
- Cho vào vial để phân tích trên máy bằng LC/MS/MS
6. Thông số chạy máy
Pha động A: Acid formic 0.1% Pha động B: ACN
6.1. Điều kiện phân tích trên LC Nhiệt độ cột: 30oC (nhiệt độ phòng)
Tốc độ dòng: 0.7 ml pha động/phút, thành phần pha động theo chế độ gradient (đã cài đặt trong máy HPLC)
Bảng 4.4. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích MG và LMG
No. Time, min A, % B, %
1 0.00 63 37 2 10.00 63 37 3 10.5 0 100 4 12 0 100 5 12.5 63 37 6 15 63 37 Thể tích tiêm mẫu: 10 ml Thời gian phân tích: 15 phút 6.2. Điều kiện phân tích trên MS
Corona discharge: 0mA Vaporizer Temp (oC): 400 Sheath gas: 70 Auxiliary gas: 40 Capillary Temp (oC): 220 Capillary Voltage (V): 40
7. Điều kiện phân mảnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Component Precursor ion (m/z) Product ion (m/z)
MG 329 313 – 315
LMG 331 239 316 8. Tính toán kết quả
Sử dụng phần mềm trên máy HPLC tính diện tích các peak MG, LMG, các MG, LMG chuẩn.
Xây dựng đường chuẩn tuyến tính giữa tỉ số diện tích MG/MG chuẩn (hoặc LMG/LMG chuẩn).
Dựa vào phương trình đường thẳng y = ax + b. Sử dụng đường chuẩn thu được tính nồng độ MG (hoặc LMG) trong mẫu thử.
4.1.3 Nhóm kháng sinh Nitrofuran:
ĐỊNH LƯỢNG NITROFURAN
TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG SẮC LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS 1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này hướng dẫn xác định hàm lượng nitrofuran và các chất chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0.5ppb.
2. Nguyên tắc
Dư lượng liên kết với mô của các chất chuyển hóa nhóm nitrofurans trong thủy sản và sản phẩm thủy sản được thủy phân bằng acid HCl loãng để thu được mạch nhánh của các chất nhóm nitrofurans (AOZ, AMOZ, AHD, SEM). Các mạch nhánh này được dẫn xuất hóa bằng 2-nitrobezaldehyd để tạo thành NP- AOZ, NP-AMOZ, NP-AHD, NP-SEM. Xác định và định lượng các chất dẫn xuất bằng LC/MS/MS
3. Thiết bị, dụng cụ.
- Hệ thống sắc ký lỏng gồm: bơm và bộ tiêm mẫu tự động.
- Đầu dò MS (ThermoQuest Finnigan TSQ Quantum)
- Phần mềm điều khiển: Xcalibur Version 1.3. - Cột LC: Inertsil ODS-3 5m 130 x 2.0mm - Tiền cột: ODS-3 5m 130 x 2.0mm
- Máy Vortex, máy lắc - Bộ thổi khí nitơ N – EVAP 4. Hóa chất
- Ethyl acetate (EtOAc) dùng trong HPLC
- Acid hydrocloric (HCl) đậm đặc.
- Aicd formic 90%
- Sodium Chloride (NaCl)
- Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate (K2HPO4) - NaOH tinh thể
- 2-Nitrobenzaldehyde
- Methnol (MeOH) dùng trong HPLC
- Nước cất
- NP-SEM, NP-AHD, NP-AMOZ và NP-AOZ (dẫn xuất 2-NBA của SEM, AHD, AMOZ, AOZ)
5. Dung dịch, thuốc thử 5.1. Thuốc thử
5.1.1. HCl 0.125M
Cho 5,2ml acid HCl đậm đặc vào bình định mức 500ml có chứa khoảng
200ml nước và định mức đến vạch bằng nước. 5.1.2. K2HPO4 0.1M (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hòa tan 17.4g K2HPO4 vào ít hơn 1L nước. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1L và định mức đến vạch bằng nước.
5.1.3. NaOH 0.8M
Hòa tan 3,2g NaOH vào ít hơn 100ml nước. Chuyển dung dịch vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước.
5.1.4. NaOH 0.125M
Pha loãng 10ml NaOH 0.8M trong 630ml nước 5.1.5. Acid formic 0.1%
Cho 1ml acid formic vào ít hơn 1L nước trong bình định mức 1L và định mức đến vạch bằng nước.
5.1.6. 2-NBA 50mM
Hòa tan 0.07555g 2-NBA trong 10ml MeOH 5.1.7. Hỗn hợp MeOH/nước = 50:50
Cho 50ml MeOH vào 50ml nước 5.2. Dung dịch chuẩn
5.2.1. Hòa tan 43, 56, 46 và 33mg NBA-AHD, NBA-SEM, NBA-AOZ và NBA-AMOZ trong 100ml MeOH theo thứ tự. Hỗn hợp gốc chứa 430 ng/ml, 560 ng/ml, 460 ng/ml, 330 ng/ml của NBA-AHD, NBA-SEM, NBA-AOZ và NBA- AMOZ theo thứ tự, nồng độ của các chất không dẫn xuất AHD, SEM, AOZ,