PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LEUCOMALACHITE GREEN BẰNG SẮC KÝ LỎNG
GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS 1 Phạm vi áp dụng
Phương pháp này hướng dẫn việc xác định dư lượng Leucomalachite Green và Malachite Green trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1ppb.
2 Nguyên tắc
MG và LMG được trích bằng dung dịch đệm acetate và acetonitrile. Tiếp theo, dịch trích được chiết tách lại bằng methylene chloride. LMG sẽ bị oxi hóa trở về dạng MG bằng phản ứng với 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone. Mẫu phân tích được làm sạch hơn bằng sự chiết với pha rắn gồm alumina và propylsulfonic acid. Cuối cùng, dịch chiết được phân tích bằng LC với bước sóng phát hiện ở 618 nm.
3 Thiết bị, dụng cụ 3.1 Thiết bị
- Hệ thống LC-MS bao gồm: - LC 1100 Agilent
- MS với nguồn ESI hoặc APCI
- Phần mềm điều khiển Xcaliber ( Version 1.3)
- Máy đồng nhất mẫu - Máy ly tâm - Vortex 3.2 Dụng cụ - Ống ly tâm 50ml - Bình định mức - Pipettes - Bình quả lê 150ml - Bình chiết 250ml
- Cột chiết pha rắn SPE: Cột Alumina (ALN-SPE), Bakerbond alumina SPE, 6ml, 500mg, acid propylsulfonic (PRS-SPE),500mg.
- Vial 2ml và một số dụng cụ khác. 4 Hóa chất, thuốc thử 4.1 Hóa chất - Nước cất, HPLC - Methanol, HPLC - Acetonitrile, HPLC - Methylene chloride
4.2 Dung dịch, thuốc thử
4.2.1 Acid formic 0.1% (pha động cho LC-MS): Hút 1ml acid formic cho vào bình định mức 1000ml và định mức đến vạch bằng nước cất.
4.2.2 Dung dịch đệm acetate: hòa tan 7.7g ammonium acetate và 5ml p- toluene sulfonic acid (p-TSA) trong nước, đều chỉnh pH về 4.5 bằng acid acetic, thêm nước để được 1 lít.
4.2.3 Dung dịch 2,3-dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoquinone (DDQ): từ dung dịch chuẩn DDQ được pha loãng trong acetonitrile để được dung dịch làm việc DDQ 0.001M
4.2.4 Một số dung dịch khác - Diethylene glycol
- Alumina
- Hydroxyamine hydrochloride 0.25g/ml - Dung dịch p-TSA 1M trong nước.
4.2.5 Dung dịch chuẩn gốc Malachite Green (MG) 100ppm: Cân 10g chuẩn MG cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol.
4.2.6 Dung dịch chuẩn trung gian MG 1ppm: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc MG (4.2.5) 100ppm cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol.
4.2.7 Dung dịch chuẩn làm việc MG 100ppb: Hút 1ml dung dịch chuẩn trung gian MG (4.2.6) 1ppm cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol.
4.2.8 Dung dịch chuẩn gốc Leucomalachite Green (LMG) 100ppm: Cân 10g chuẩn LMG cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol.
4.2.9 Dung dịch chuẩn bố sung LMG 1ppm: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc LMG (4.2.8) 100ppm cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng methanol.
4.2.10 Dung dịch chuẩn làm việc LMG 100ppb: Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc LMG (4.2.9) 1ppm cho vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng methanol.
5. Các bước chuẩn bị mẫu
Mẫu được đồng nhất trước khi tiến hành ly trích, bảo quản mẫu bằng nước đá khô hoặc trữ đông ở -20oC đến khi phân tích.
5.1 Chuẩn bị mẫu thử
Cân 5g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml. 5.2 Chuẩn bị mẫu trắng
Cân 5g mẫu không chứa MG và LMG cho vào ống ly tâm 50ml. 5.3 Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn
Chuẩn bị lần lượt 6 mẫu trắng mỗi mẫu 5g cho vào ống ly tâm 50ml và bổ sung dung dịch chuẩn làm việc MG 100ppb và dung dịch chuẩn làm việc LMG 100ppb để được dãy đường chuẩn có nồng độ lần lượt là 0, 1, 2, 4, 10 và 20ppb. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 4.3. Thể tích và nồng độ tương ứng khi thêm MG và LMG vào mẫu trắng để dựng đường chuẩn Thể tích (µl) Nồng độ trong mẫu (ppb) MG 100ppb LMG 100ppb MG LMG 0 0 0 0 50 50 1 1 100 100 2 2 200 200 4 4 500 500 10 10 1000 1000 20 20
Sau đó tiến hành ly trích mẫu qua các bước sau:
- Thêm vào các ống nhựa chứa mẫu 5ml dung dịch đệm acetate, 100ml dung dịch p-TSA 1M, 1ml hydroxyamine (0.25g/ml). Lắc đều.
- Thêm 25 ml acetonitrile, lắc 30 giây. Sau đó thêm tiếp 5 – 6g alumina và lắc tiếp 15 giây. Ly tâm 4000rpm ở 0oC. Chuyển dịch trong vào bình chiết thủy tinh 250 ml đã chứa sẵn 50 ml nước và 2 ml diethylene glycol.
- Thêm 25 ml acetonitrile vào ống chứa mẫu. Chuyển dịch trong vào cùng bình chiết thủy tinh 250 ml ở bước trên.
- Thêm 25 ml methylene chloride vào trong bình chiết. Lắc nhẹ và để yên cho tách lớp. Chuyển lớp methylene chloride (ở dưới) vào trong bình cầu quả lê 150 ml.
- Cô dịch trong bình cầu quả lê cho đến khô trên máy cô quay chân không.
- Hòa tan cặn khô bằng 3 ml ACN và 3ml DDQ 0.001M để oxi hóa LMG về dạng MG.
- Cho qua hệ thống chiết pha rắn với alumina và acid propylsulfonic với tốc độ 4ml/min.
- Rửa cột bằng acetonitrile và MG được rửa giải bằng 4ml dung dịch đệm acetonitrile: ammonium acetate (50:50) và định mức lên 5ml cho mỗi mẫu.
- Cho vào vial để phân tích trên máy bằng LC/MS/MS
6. Thông số chạy máy
Pha động A: Acid formic 0.1% Pha động B: ACN
6.1. Điều kiện phân tích trên LC Nhiệt độ cột: 30oC (nhiệt độ phòng)
Tốc độ dòng: 0.7 ml pha động/phút, thành phần pha động theo chế độ gradient (đã cài đặt trong máy HPLC)
Bảng 4.4. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích MG và LMG
No. Time, min A, % B, %
1 0.00 63 37 2 10.00 63 37 3 10.5 0 100 4 12 0 100 5 12.5 63 37 6 15 63 37 Thể tích tiêm mẫu: 10 ml Thời gian phân tích: 15 phút 6.2. Điều kiện phân tích trên MS
Corona discharge: 0mA Vaporizer Temp (oC): 400 Sheath gas: 70 Auxiliary gas: 40 Capillary Temp (oC): 220 Capillary Voltage (V): 40
7. Điều kiện phân mảnh
Component Precursor ion (m/z) Product ion (m/z)
MG 329 313 – 315
LMG 331 239 316 8. Tính toán kết quả
Sử dụng phần mềm trên máy HPLC tính diện tích các peak MG, LMG, các MG, LMG chuẩn.
Xây dựng đường chuẩn tuyến tính giữa tỉ số diện tích MG/MG chuẩn (hoặc LMG/LMG chuẩn).
Dựa vào phương trình đường thẳng y = ax + b. Sử dụng đường chuẩn thu được tính nồng độ MG (hoặc LMG) trong mẫu thử.