ĐỊNH LƯỢNG NITROFURAN
TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG SẮC LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC/MS/MS 1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này hướng dẫn xác định hàm lượng nitrofuran và các chất chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0.5ppb.
2. Nguyên tắc
Dư lượng liên kết với mô của các chất chuyển hóa nhóm nitrofurans trong thủy sản và sản phẩm thủy sản được thủy phân bằng acid HCl loãng để thu được mạch nhánh của các chất nhóm nitrofurans (AOZ, AMOZ, AHD, SEM). Các mạch nhánh này được dẫn xuất hóa bằng 2-nitrobezaldehyd để tạo thành NP- AOZ, NP-AMOZ, NP-AHD, NP-SEM. Xác định và định lượng các chất dẫn xuất bằng LC/MS/MS
3. Thiết bị, dụng cụ.
- Hệ thống sắc ký lỏng gồm: bơm và bộ tiêm mẫu tự động.
- Đầu dò MS (ThermoQuest Finnigan TSQ Quantum)
- Phần mềm điều khiển: Xcalibur Version 1.3. - Cột LC: Inertsil ODS-3 5m 130 x 2.0mm - Tiền cột: ODS-3 5m 130 x 2.0mm
- Máy Vortex, máy lắc - Bộ thổi khí nitơ N – EVAP 4. Hóa chất
- Ethyl acetate (EtOAc) dùng trong HPLC
- Acid hydrocloric (HCl) đậm đặc.
- Aicd formic 90%
- Sodium Chloride (NaCl)
- Dipotassium hydrogen phosphate trihydrate (K2HPO4) - NaOH tinh thể
- 2-Nitrobenzaldehyde
- Methnol (MeOH) dùng trong HPLC
- Nước cất
- NP-SEM, NP-AHD, NP-AMOZ và NP-AOZ (dẫn xuất 2-NBA của SEM, AHD, AMOZ, AOZ)
5. Dung dịch, thuốc thử 5.1. Thuốc thử
5.1.1. HCl 0.125M
Cho 5,2ml acid HCl đậm đặc vào bình định mức 500ml có chứa khoảng
200ml nước và định mức đến vạch bằng nước. 5.1.2. K2HPO4 0.1M
Hòa tan 17.4g K2HPO4 vào ít hơn 1L nước. Chuyển dung dịch vào bình định mức 1L và định mức đến vạch bằng nước.
5.1.3. NaOH 0.8M
Hòa tan 3,2g NaOH vào ít hơn 100ml nước. Chuyển dung dịch vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước.
5.1.4. NaOH 0.125M
Pha loãng 10ml NaOH 0.8M trong 630ml nước 5.1.5. Acid formic 0.1%
Cho 1ml acid formic vào ít hơn 1L nước trong bình định mức 1L và định mức đến vạch bằng nước.
5.1.6. 2-NBA 50mM
Hòa tan 0.07555g 2-NBA trong 10ml MeOH 5.1.7. Hỗn hợp MeOH/nước = 50:50
Cho 50ml MeOH vào 50ml nước 5.2. Dung dịch chuẩn
5.2.1. Hòa tan 43, 56, 46 và 33mg NBA-AHD, NBA-SEM, NBA-AOZ và NBA-AMOZ trong 100ml MeOH theo thứ tự. Hỗn hợp gốc chứa 430 ng/ml, 560 ng/ml, 460 ng/ml, 330 ng/ml của NBA-AHD, NBA-SEM, NBA-AOZ và NBA- AMOZ theo thứ tự, nồng độ của các chất không dẫn xuất AHD, SEM, AOZ, AMOZ tương ứng đều là 200 ng/ml.
5.2.2. Pha loãng hỗn hợp gốc trên 500 lần để được dung dịch chuẩn D500: Cho 10ml dung dịch gốc cộng 5ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.4 ng/ml)
5.2.3. Dung dịch chuẩn D1000: Cho 2ml dung dịch D500 cộng 2ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.2 ng/ml)
5.2.4. Dung dịch chuẩn D2000: Cho 2ml dung dịch D1000 cộng 2ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.1 ng/ml)
5.2.5. Dung dịch chuẩn D4000: Cho 2ml dung dịch D2000 cộng 2ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.05 ng/ml)
5.2.6. Dung dịch chuẩn D8000: cho 2ml dung dịch D4000 cộng 2ml dung dịch hỗn hợp MeOH/nước = 50:50 (nồng độ của các chất không dẫn xuất là 0.025 ng/ml)
6. Các bước chuẩn bị mẫu
6.1. Chuẩn bị mẫu thử: Bóc vỏ nguyên liệu (nếu có) cho vào máy xay mẫu và xay nhuyễn cho đến khi mẫu đồng nhất.
Cân chính xác 2.0 (± 0.1)g mẫu cho vào ống ly tâm polypropylene 50ml, ghi lại khối lượng mẫu.
6.2. Chuẩn bị mẫu trắng: Cân chính xác 2.0 (± 0.1)g mẫu cho vào ống ly tâm polypropylene 50ml, ghi lại khối lượng mẫu. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như mẫu thử.
6.3. Chuẩn bị mẫu để dựng đường chuẩn: Cân 5 mẫu trắng mỗi mẫu có khối lượng 2.0 (± 0.1)g cho vào ống ly tâm 50ml và tiến hành chuẩn bị như mẫu thử. Thêm dung dịch chuẩn D8000 để đươc dãy chuẩn có nồng độ 0, 0.3, 0.6, 0.9, 1.2ppb.
6.4. Thêm 10ml HCl 0.125M và 400ml 2-NBA 50mM vào mỗi mẫu, đậy nắp lại và vortex trong 15 giây.
6.5. Ủ mẫu trong 16 giờ ở 37oC với máy lắc 80rpm.
6.6. Sau khi ủ để mẫu ở nhiệt độ phòng. Thêm 1ml K2HPO4 0.1M và 1 ml NaOH 0.8M. Vortex trong 15 giây
6.7. Điều chỉnh pH khoảng 7.3 ± 0.2 với HCl 0.125M và NaOH 0.125M. Ghi nhận pH cuối cùng. Thể tích cuối cùng của mẫu không hơn 20ml. Ghi nhận thể tích cuối cùng
6.8. Ly tâm mẫu ở 4o
C và 3000 rpm trong 5 phút .
6.9. Hút phần dịch lỏng ở trên sau ly tâm qua một ống ly tâm 50ml thứ hai, thêm 3ml nước vào phần thịt tôm còn lại, tiếp tục vortex 15 giây, ly tâm ở 4oC và 3000 rpm trong 5 phút.
6.10. Hút hết lớp dung dịch phía trên sau khi ly tâm cho vào ống ly tâm thứ hai trên.
6.11. Thêm nước để định mức dung dịch đến thể tích 20ml, thêm khoảng
0.5g NaCl và 12 ml EtOAc, đậy nắp lại và vortex trong 15 giây, ly tâm ở 4o
C và 3000 rpm trong 5 phút.
6.12. Hút lấy lớp trên cho vào ống ly tâm 15 ml khác, thêm 2ml nước, hút lớp dưới (nước) bỏ.
6.13. Thổi khô dịch chiết bằng khí nitơ ở 40o C
6.14. Thêm 1ml dung dịch MeOH/nước = 50:50, vortex 15 giây 6.15. Lọc dịch chiết cho vào vial 1.8ml để phân tích trên LC/MS/MS 7. Thông số chạy máy
7.1. Thông số cho LC
Pha động A: Acid formic 1% trong nước Pha động B: MeOH
Thời gian phân tích: 30 phút Gradient Program
Bảng 4.5. Chương trình pha động cho LC của phương pháp phân tích Nitrofuran
7.2. Thông số cho MS
Source: ESI
ESI capillary position (oC): 90 Spay voltage (V): 4000 Sheath gas pressure (bar): 35 Aux gas pressure (bar): 3 Capillary temperature: 300oC Tube lens offset (V): 121 Capillary Offset (V): 35
Q2 Collision gas: 1.5 mTorr Injection volume (ml): 40.00 Flush volume (ml): 400 Needle height from bottom (mm): 0.2 Wash volume (ml): 400 Flush speed (ml/s): 250 Post – Injection Valve switch time (min): 0 Loop loading speed (ml/s): 5 Syringe speed (ml/s): 8 Tray temp control is on. Temp (oC): 10 Column oven control is on. Temp (oC): 30 Min. pressure (bar): 0 Max. pressure (bar): 431
Time, min Flow, ml/min A, % B, % 0 - 8 0.15 45 55 8 – 8.5 0.15 45 - 0 55 - 100 8.5 – 8.7 0.15 –0.30 0 100 8.7 - 15 0.3 0 100 15 – 15.5 0.3 0 - 45 100 - 55 15.5 - 20 0.3 45 55 20 - 21 0.3 –0.15 45 55 21 - 30 0.15 45 55
Bảng 4.6. Điều kiện phân mảnh MS/MS của hỗn hợp dẫn xuất của các chất trong nhóm Nitrofuran Component Precursor ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time (s) Collision energy (eV) NP-SEM 209 134 166 192 0.2 0.2 0.2 13 11 15 NP - AOZ 236 104 134 149 0.2 0.2 0.2 15 12 13 NP - AHD 249 104 134 178 0.2 0.2 0.2 15 13 13 NP - AMOZ 335 128 262 291 0.2 0.2 0.2 8 10 12 8. Tính toán kết quả
Sử dụng phần mềm trên máy HPLC tính diện tích các peak của các chất dẫn xuất và các chất chuẩn thêm vào.
Xây dựng đường chuẩn tuyến tính giữa tỉ số các chất dẫn xuất và các chất chuẩn thêm vào.
Dựa vào phương trình đường thẳng y = ax + b. Sử dụng đường chuẩn thu được tính nồng độ các chất cần phân tích.
Phần mềm quản lý sẽ tự tính kết quả.