Chương 1 : TỔNG QUAN
1.4. Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm Rickettsiaceae
1.4.1. Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học
1.4.1.1. Phương pháp Weil - Felix
Phương pháp Weil - Felix được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1916 bởi Edmund Weil và Arthur Felix. Phương pháp này đã được áp dụng để chẩn đoán Rickettsiaceae trong một khoảng thời gian dài trên toàn thế giới [12]. Đây là phương pháp chẩn đoán đơn giản dựa trên sự phản ứng chéo xảy ra giữa các kháng thể được tạo ra trong giai đoạn nhiễm Rickettsiaceae cấp tính với các kháng nguyên dòng OX (OX19, OX2, OXK) của các lồi Proteus.
Trong đó, các Rickettsiaceae nhóm sốt phát ban (R. prowazekii, R. typhi)
phản ứng với P. vulgaris OX19; nhóm sốt mị (Ọ tsutsugamushi) phản ứng với P. mirabilis OXK; nhóm sốt đốm (R. rickettsii, R. africae, R. japonica,...)
phản ứng với P. vulgaris OX2 và OX19 [87]. Phương pháp Weil - Felix được thực hiện 2 cách.
- Cách thứ nhất: Chuẩn bị một lam kính, nhỏ một giọt (50 - 100 µl) huyết thanh bệnh nhân lên bề mặt lam kính. Bổ sung 1 giọt kháng nguyên muốn kiểm tra, trộn lẫn hỗn hợp trong 1 phút. Kết quả dương tính khi có xuất hiện sự kết dính, tương ứng ngưỡng khảng 1:20.
- Cách thứ hai: Sử dụng 0,25% phenol làm chất pha loãng, sau đó pha lỗng một dãy các ống 1ml có nồng độ huyết thanh bệnh nhân hơn kém nhau hai lần. Một giọt dung dịch kháng nguyên được thêm vào mỗi ống, trộn đều và ủ ở nhiệt độ 50 - 55oC trong thời gian từ 4 - 6 giờ. Khi các ống xuất hiện kết tủa hay tạo hạt được cho là dương tính, với nồng độ ngưỡng phát hiện khoảng 1:320.
Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế là độ nhạy và độ đặc hiệu thấp. Một vài nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, xét nghiệm này có độ nhạy khoảng 33% và độ đặc hiệu 46% [88]. Vì vậy,phương pháp Weil- Felix đang dần được thay thế bằng các phương pháp huyết thanh học khác, như xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA), xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) - được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, tại các cơ sở nhỏ hạn chế về mặt kĩ thuật, xét nghiệm Weil- Felix vẫn là một cơng cụ có thể áp dụng trong chẩn đốn các căn nguyên gây bệnh sốt do Rickettsiaceaẹ
1.4.1.2. Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA)
Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - ELISA), còn được gọi là Enzyme Immunoassay (EIA), là một kỹ thuật ứng dụng nguyên lý kháng nguyên - kháng thể để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫụ
Năm 1971, Peter Perlmann và Eva Engvall tại Đại học Stockholm - Thụy Điển, Anton Schuurs và Bauke van Weemen ở Hà Lan đã độc lập xuất bản các bài báo tổng hợp các kiến thức từ những phương pháp trước đây để mô tả đầy đủ phương pháp ELISẠ Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản sau: Gắn kháng nguyên chưa biết lên bề mặt. Dùng kháng thể đã biết trước đã được gắn ezyme “rửa” qua bề mặt đó. Thêm vào một cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Giữa mỗi bước, các đĩa thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ các protein hoặc các kháng thể không gắn. Sau bước rửa cuối cùng, cơ chất của enzyme được thêm vào để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy, giúp chỉ ra số lượng kháng nguyên trong mẫu [89].
Do có những ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu và khả năng sản xuất kit thương mại, ELISA được khuyến cáo sử dụng như xét nghiệm chuẩn cho
chẩn đốn các lồi Rickettsiaceae ở vùng bệnh lưu hành. Tuy nhiên phương pháp này còn những hạn chế trong việc chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm do cơ thể chưa kịp sinh kháng thể hoặc kháng thể còn ở nồng độ thấp [90].
1.4.1.3. Xét nghiệmkháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA)
Xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent Antibody - IFA) lần đầu tiên được Bozeman và cộng sự mô tả vào năm 1963. Sau đó, nó đã được thay đổi để cho phép sử dụng lượng huyết thanh và kháng nguyên nhỏ hơn. Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến nhằm chẩn đốn nhanh chóng bệnh nhân nhiễm Rickettsiaceaẹ
Phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ nhạy caọ Tuy nhiên sự khác nhau giữa các lồi Rickettsiaceae khó phân biệt do có phản ứng chéo đối với
các kháng thể. Nhằm khắc phục hạn chế đó, một phương pháp được phát triển bởi phịng thí nghiệm tham chiếu Rickettsiaceae của Úc đã tối ưu hoá phương pháp này, tăng giá trị ngưỡng phát hiện lên 1:128 nhằm giảm tỉ lệ dương tính giả. Vì vậy, IFA đang được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán huyết thanh học.
Tuy nhiên, gần đây các phương pháp chẩn đoán bằng sinh học phân tử đã được kiểm chứng có thể giúp chẩn đốn nhanh chóng, chính xác hơn ở giai đoạn đầu của bệnh [91]. Trong một nghiên cứu mới đây của Cherry Lim và cộng sự (2015), 24 bệnh nhân bị nhiễm sốt Dengue, được kiểm tra bằng IFA IgM - STG cho kết quả 5 bệnh nhân dương tính. Trong khi đó với các xét nghiệm ni cấy tế bào, hay phương pháp PCR đều cho kết quả âm tính. Kết quả trên cho thấy, độ đặc hiệu của phương pháp IFA thấp hơn so với phương pháp PCR [92].