Chương 1 : TỔNG QUAN
1.4. Xét nghiệm chẩn đoán nhiễm Rickettsiaceae
1.4.3. Các xét nghiệm sinh học phân tử
Hiện nay với tiến bộ trong khoa học, kỹ thuật, kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng ngày càng nhiều đã giúp nâng cao độ nhạy cũng như độ đặc hiệu của xét nghiệm chẩn đoán và phát hiện nhiễm Rickettsiaceae trên lâm
sàng [32].
1.4.3.1. Phương pháp khuếch đại chuỗi gen (PCR)
Phương pháp Polymerase Chain Reaction - PCR dựa trên nguyên lý khuếch đại nhanh, nhiều bản sao các đoạn DNA mà khơng qua tạo dịng. Phương pháp này được Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Năm 1990, kĩ thuật PCR lần đầu được sử dụng để phát hiện Orientia ở bệnh phẩm lâmsàng và cho kết quả tốt. Từ đó đến nay, phương pháp PCRđã được sử dụng ngày càng phổ biến.
Phương pháp PCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNẠ Đây là một
phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA nàỵ Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được kéo dài để hình thành mạch mớị
PCR là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, nhanh chóng phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu bệnh phẩm ở giai đoạn nhiễmRickettsia cấp, trước khi có kháng thể đặc hiệu [94]. Các kỹ thật PCR cải tiến gần đây như nested PCR, heminested PCR hoặc PCR lặp lại (reamplified PCR) và gần đây là realtime PCR và PCR - RFLP cho phép phát hiện Rickettsiaceae trong bệnh phẩm lâm sàng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với PCR ban đầu [9], [95].
1.4.3.2. Phương pháp khuếch đại chuỗi gen lồng (Nested PCR)
Nested PCR là một dạng thay đổi của PCR thường, trong đó hai cặp mồi PCR được dùng để khuếch đại đoạn DNẠ Phản ứng nested PCR phải được thực hiện hai lần. Lần đầu, phản ứng PCR được thực hiện trong 15 đến 30 chu kỳ, với cặp mồi thứ 1, cho phép khuếch đại đoạn gen dài hơn đoạn gen cần xác định. Sản phẩm PCR lần 1 sau đó sẽ là mẫu cho PCR lần 2, cặp mồi thứ 2 sẽ bắt cặp phía trong của sản phẩm PCR lần 1 và khuếch đại đoạn gen cần xác định.
Ưu điểm của nested PCR là tăng độ đặc hiệu vì phản ứng PCR lần 2 chỉ xảy ra dựa trên sản phẩm của PCR lần 1. Đồng thời phương pháp này tăng độ nhạy vì tổng số chu kỳ nhân lên nhiều hơn (giảm ngưỡng phát hiện xuống tương đương từ 1 đến 10 bản copies trên 1 phản ứng). Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này dễ lây nhiễm do phải chuyển mẫu giữa hai lần thực hiện phản ứng. PCR dùng sản phẩm tự hủy (Suicide PCR) là phương pháp PCR lồng giúp giảm thiểu dương tính giả do amplicons, dựa trên nguyên lý mỗi mồi chỉ tác dụng với 1 mảnh DNA đích. Phương pháp này có độ đặc hiệu 100% và độ nhạy 68% [96].
1.4.3.3. Phương phápkhuếch đại chuỗi gen Real time PCR
Realtime PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm lên hàng tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại đích thể hiện ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng bằng cách thu nhận các tín hiệu huỳnh quang. Trong q trình xảy ra phản ứng, có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu xuất hiện trong ống PCR đầu dị đặc hiệu (Taqman probe) với trình tự đích sẽ bắt cặp vào sản phẩm khuếch đại và sẽ bị phân giải bởi enzyme taqpolymerase (nhờ hoạt tính 5’-3’ exonuclease) khi tổng hợp sợi bổ sung ở giai đoạn kéo dàị Sự phân giải Taqman probe sẽ làm tách rời chất phát huỳnh quang (fluorophore) FAM ở đầu 5’ khỏi chất hấp phụ huỳnh quang (quencher) ở đầu 3’của probe, nhờ vậy ống phản ứng sẽ phát huỳnh quang khi bị chiếu tia cực tím hay laser và sự phát huỳnh quang này sẽ được ghi nhận bởi đầu đọc realtime của máỵ
Realtime PCR cho phép phát hiện tác nhân gây bệnh ở ngưỡng phát hiện rất thấp, kết quả định lượng trực tiếp theo thời gian và độ nhạy tương tự PCR lồng, đồng thời lại khơng có nguy cơ nhiễm bẩn. Do đó, hiện nay PCR định lượng đang là kĩ thuật sinh học phân tử được ưu tiên sử dụng để chẩn đoán Rickettsioses [95], [97], [98].
So với kĩ thuật PCR thường, kỹ thuật realtime PCR có nhiều ưu việt hơn như: Nguy cơ ngoại nhiễm thấp hơn (do là q trình kín), nhanh hơn, độ đặc hiệu cao hơn và có khả năng định lượng chính xác nồng độ mẫu bệnh phẩm. Do những ưu việt trên, trong những năm gần đây, kĩ thuật realtime PCR đã được phát triển rộng rãi trong các phòng thí nghiệm để chẩn đốn các bệnh truyền nhiễm, đặc biệt là các bệnh nhiễm Rickettsiaceae và vi rút, bởi phương pháp này cho phép chẩn đoán nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao [95].
1.4.3.4. Kĩ thuật PCR đa hình dùng enzyme giới hạn (PCR - RFLP)
Kĩ thuật PCR đa hình dùng enzyme giới hạn (PCR - RFLP) cho phép phân tích DNA sử dụng enzyme giới hạn và điện di điện trường xung phù hợp
để xác định kiểu gen mớị Dùng kĩ thuật PCR - RLFP để phân tích các protein rOmpA, rOmpB, 120 kDa, 17 kDa và gen tổng hợp citrate (gltA) và/hoặc kết hợp với kỹ thuật giải trình tự (sequencing) các sản phẩm DNA từ PCR đang trở thành phương pháp chính để xác định nhanh chóng các lồi Rickettsiaceae và kiểu gen khác nhaụ Khi phân tích thơng tin tổng hợp các từ gen gltA và các gen quy định các protein rOmpA, rOmpB và 17 kDa bằng phương pháp PCR - RFLP sẽ giúp xác định được các loài và các kiểu gen khác nhau gây bệnh sốt mò và sốt phát ban do Rickettsiaceae.
1.4.3.5. Giải trình tự gen nhiều Locus (Multilcus Sequencing Typing - MLST)
Kỹ thuật giải trình tự gen nhiều locus (MLST) dùng để phân tích các trình tự nucleotid của các gen có tính bảo tồn cao “housekeeping genes” để xác định mối liên quan giữa các trình tự giải được với các alen đã được biết. Khi so sánh các trình tự này với các chủng mẫu sẽ cung cấp thông tin đủ để phân biệt sự khác nhau giữa các căn ngun mà khơng cần phải giải trình tự tồn bộ bộ gen. Kỹ thuật MLST đã được dùng để xác định các kiểu gen của
Ọ tsustugamushi ở Thái Lan và Campuchia, cả 2 nghiên cứu đều dựa trên 7
gen bảo tồn “housekeeping genes” có chức năng lõi (core - function) [99], [100]. Kết quả 2 nghiên cứu trên đã cho thấy, có sự đa dạng và tái tổ hợp cao, mang tính địa phương của các quần thể Ọ tsustugamushi trong tự nhiên. Kết quả xét nghiệm MLST cũng cho thấy, 25% bệnh nhân nhiễm đồng thời nhiều chủng Ọ tsustugamushi khác nhau, có thể do nhiều loại mị đốt hoặc nhiều chủng cùng tồn tại trên một loại mò [99]. Nghiên cứu cũng cho thấy, giải trình tự gen mã hóa cho protein màng ngồi 56 kDa TSA bằng phương pháp MLST ít giá trị so với các gen mã hóa enzyme chuyển hóa ở trong nhân tế bào, mặc dù trình tự gen 56 kDa TSA được biết là có tính đặc hiệu và đáp ứng miễn dịch caọ Hiện nay chưa rõ phương pháp nào ưu việt hơn, cần tiến hành giải trình tự tồn bộ bộ gen để so sánh giữa 2 phương pháp trên [25].