Tên Trình tự (5’-3’) Primer 47 F AACTGATTTTATTCAAACTAATGCTGCT Primer 47 R TATGCCTGAGTAAGATACRTGAATRGAATT Probe 47 6FAM-TGGGTAGCTTTGGTGGACCGATGTTTAATCT-TAMRA Primer 17 F GGGCGGTATGAAYAAACAAG Primer 17 R CCTACACCTACTCCVACAAG Probe 17 FAM-CCGAATTGAGAACCAAGTAATGC-TAMRA
Primer OmpB F TGGTATTACTGCTCAACAAGCT Primer OmpB R CAGTAAAGTCTATTGATCCTACACC
Probe OmpB FAM-CGCGATCGTTAATAGCAGCACCAGCATTATCGCG-BHQ1
- Các bước tiến hành
+ Tách chiết lớp bạch cầu máu đơn nhân ngoại vi (PBMC)
• 4ml máu được thu vào ống có chứa chất chống đơng EDTẠ Hút 2ml dung dịch Ficoll cho vào ống Falcon 15ml. Sau đó, hút tồn bộ 4ml máu đã thu nhả từ từ và nhẹ nhàng vào ống sao cho lớp máu nằm trên lớp Ficoll.
• Ly tâm 1800 vịng/phút trong 20 phút ở nhiệt độ phịng.
• Sau khi ly tâm hỗn hợp máu và ficoll được tách thành 4 lớp. Tiến hành hút lớp trên cùng chứa huyết tương ra ống cryotube 2ml. Hút hết lớp tiếp theo chứa PBMC ra ống cryotube 2ml.
• Ly tâm 1800 vòng/phút trong 20 phút ở nhiệt độ phòng, thu tủa và
+ Tách chiết DNA từ PBMC
ã Bc 1: Hỳt 20 àl proteinase K vo ống eppendorf 1,5 ml.
• Bước 2: Cho tiếp 200 µl PBMC vào ống sau đó cho thêm 200 µl lysis buffer AL. Trộn đều bằng cách votex trong 15 giâỵ
• Bước 3: Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 560C trong 10 phút.
• Bước 4: Ly tâm để đẩy những dung dịch bám ở nắp ống xuống phía dướị • Bước 5: Bổ sung thêm 200 µl ethanol (96 – 100%), trộn đều bằng votex trong 15 giâỵ Sau khi trộn, ly tâm nhanh để đẩy dung dịch bám ở nắp ống xuống phía dướị
• Bước 6: Cẩn thận chuyển toàn bộ dung dịch ở bước 5 lên cột lọc (đã có ống hứng loại 2 ml ở dưới). Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vịng/phút trong 1 phút. Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mớị
• Bước 7: Mở nắp cột lọc cẩn thận, thêm 500 µl Wash buffer AW1. Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vịng/phút trong 1 phút. Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mớị
• Bước 8: Mở nắp cột lọc cẩn thận, thêm 500 µl Wash buffer AW2. Đóng nắp và ly tâm ở 14000 vịng/phút trong 3 phút. Loại bỏ ống hứng có chứa dịch, chuyển cột lọc sang một ống hứng mớị
• Bước 9: Đặt cột lọc vào một ống hứng mới, ly tâm khô ở 14000 vịng/ phút trong 1 phút.
• Bước 10: Loại bỏ ống hứng có chứa dịch và đặt cột lọc vào một ống eppendorf 1,5 ml mớị Mở nắp cột lọc cẩn thận, cho 50 µl Elution buffer AẸ Đóng nắp và ủ ở nhiệt độ phịng trong 1 phút. Ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút.
Sử dụng chứng âm là nước cất đã được khử trùng. Tiến hành tách chứng âm đồng thời với các bệnh phẩm khác.
+ Chuẩn bị Mix cho phản ứng Realtime PCR
• Kapa Robust Master Mix là hỗn hợp hóa chất chứa thành phần buffer, dNTP, Taq DNA polymerase đã được tối ưu hóa cho phản ứng PCR.
• Số lượng ống PCR cần cho một mẻ chạy PCR theo công thức: Số lượng ống = Số bệnh phẩm +2.
• Chứng dương: là plasmit chuẩn được cung cấp từ Phịng thí nghiệm
Rickettsia, Trung tâm nghiên cứu y sinh Naval - Mỹ để phát hiện 3 nhóm vi
khuẩn Rickettsia gây bệnh sốt cấp tính [151]. • Chứng âm: Nước cất
Một lần chạy Realtime PCR cần tiến hành đồng thời 2 loại chứng gồm: Chứng dương để đảm bảo các sinh phẩm và phản ứng PCR đã tiến hành đúng; Chứng âm để đảm bảo quá trình tách chiết DNA không bị bội nhiễm.
+ Thực hiện phản ứng realtime PCR
• Tiến hành làm tan đá các ống trong kit Kapa Robust Master Mix, 2X và các ống chứa primer, sau đó cho vào block lạnh.
• Lấy 1 ống eppendorf loại 1,5 ml đã khử trùng, khơng chứa RNase và để trong block lạnh, sau đó phối trộn các thành phần của Mix theo công thức theo như trong bảng 2.4.