CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3. Kết quả các chỉ tiêu sinh hóa (Lipid máu, uric acid, insulin)
3.1. Nhóm chỉ số lipid máu
Bảng 3. 2. Bảng các chỉ số lipid máu của các nhóm chuột thí nghiệm.
* Các giá trị trong biểu đồ biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 7)
Các giá trị có ký hiệu khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).
Ảnh hƣởng lên tổng cholesterol trong máu: Dựa vào bảng kết quả cho thấy ngoại trừ nhóm đối chứng C, các nhóm cịn lại đều sử dụng khẩu phần n có hàm lƣợng chất béo cao nhƣ nhau nhƣng kết quả về tổng cholesterol lại khác biệt. Hàm lƣợng cholesterol tổng trong máu của nhóm đối chứng C-HF là cao nhất so với tất cả. Hai nhóm HW-HF và MW- HF có tổng cholesterol cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng C. Riêng hai nhóm sử dụng protein trong nghiên cứu (HP-HF và MP-HF) có tổng cholesterol là tƣơng đƣơng nhau và thấp nhất trong các nhóm, thấp hơn nhóm đối chứng C.
Ảnh hƣởng lên hàm lƣợng Triglyceride trong máu: Dựa vào bảng kết quả, nhóm đối chứng C có khẩu phần n thơng thƣờng nên hàm lƣợng Triglyceride trong máu ở mức thấp nhất. N m nhóm c n lại đều cho kết quả hàm lƣợng triglyceride cao hơn nhóm đối chứng C. Tuy nhiên, giữa các nhóm đó có sự khác biệt rõ rệt. Hai nhóm sử dụng whey protein (HW-HF và MW-HF) có hàm lƣợng triglyceride cao trong máu, nhóm MW-MF cao nhất trong 6 nhóm chuột khảo sát với chỉ số triglyceride gần nhƣ gấp 4 lần nhóm đối chứng C. Hai nhóm sử dụng protein trong nghiên cứu (MP-HF và HP-HF) cho kết quả nhƣ sau, nhóm MP-HF có hàm lƣợng triglyceride tƣơng đƣơng nhóm đối chứng C-HF và cao
Nhóm Cholesterol total (TC) (mg/dL) Triglyceride (TG) (mg/dL) HDL- C (mg/dL) LDL- C (mg/dL) TG/HDL- C Tuần 0 4,23f 1,33b 2,73e 1,2d 1,55d Tuần 7 C 2,98c 1,14a 1,90b 0,9c 1,57e C – HF 5,04g 1,87d 2,74f 1,8e 1,83f MW – HF 4,06e 4,32g 2,59d 1,2d 1,57e HW – HF 3,58d 2,15f 2,59d 0,8b 1,39a MP – HF 2,80b 1,95e 1,88a 0,7a 1,48c HP – HF 2,78a 1,35c 1,96c 0,7a 1,41b
43
hơn nhóm đối chứng C. Nhóm HP-HF có hàm lƣợng triglyceride cao hơn khơng đáng kể so với nhóm đối chứng C và thấp nhất trong n m nhóm chuột n khẩu phần giàu chất béo.
Ảnh hƣởng lên hàm lƣợng HDL và LDL trong máu: Bảng kết quả cho thấy sự khác nhau rõ rệt về HDL và LDL giữa các nhóm chuột thí nghiệm. Ba nhóm C-HF, HW-HF và MW-HF lại cho hàm lƣợng HDL cao hơn so với 3 nhóm C, HP-HF và MP-HF. Tuy nhiên về chỉ số LDL trong máu, nhóm đối chứng CF cho kết quả cao vƣợt trội trong các nhóm, gấp đơi so với nhóm đối chứng C và HP-HF, MP-HF. Hai nhóm sử dụng protein trong nghiên cứu (HP-HF và MP-HF) cho kết quả đo LDL thấp nhất trong các nhóm chuột và thấp hơn cả nhóm đối chứng C. Nhóm MW-HF cũng cho kết quả LDL cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng C. Tỷ số cholesterol tổng/HDL giữa các nhóm chuột cũng có sự khác biệt rõ rệt dựa vào bảng kết quả. Nhóm chuột đối chứng C-HF có tỷ số cao nhất, trong khi các nhóm cịn lại có tỷ số ở mức tƣơng đƣơng nhau. Riêng hai nhóm sử dụng protein trong nghiên cứu (HP-HF và MP-HF) có tỷ số thấp hơn nhóm đối chứng C và nhóm sử dụng whey protein (MP-HF). Đây là một dấu hiệu tốt cho việc kiểm soát và hạn chế đƣợc các nguy cơ tiềm ẩn về bệnh tim mạch, đột quỵ ở những ngƣời hấp thu hàm lƣợng chất béo cao trong các bữa n.
Nhƣ vậy qua nghiên cứu cho thấy việc n khẩu phần n giàu chất béo đã t ng cholesterol toàn phần (TC), Triglyceride (TG), và LDL (Low density lipoprotein cholesterol) trong máu. Do hấp thu nhiều chất béo trong khẩu phần n làm t ng tổng hợp và hấp thụ chylomicron, dẫn đến t ng mức TC và TAG, cũng nhƣ sản xuất VLDL nội sinh (Jang và cộng sự, 2008). Ngoài ra, t ng hydroxymethylglutaryl-CoA reductase và giảm hoạt động lipoprotein lipase đƣợc cho là khẩu phần n giàu béo gây ra làm rối loạn lipid máu. Tuy nhiên khi sử dụng khẩu phần n giàu béo có fish protein hydroylysate từ cá tra cho thấy các triệu chứng đều giảm đáng kế. Tác động này có thể là kết quả của một số cơ chế, bao gồm giảm hấp thu cholesterol, ức chế sinh tổng hợp cholesterol, t ng dị hóa cholesterol thành mật và bài tiết cùng với mật từ gan vào ruột. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng chế phẩm protein hydroylysate từ cá làm giảm nồng độ cholesterol trong máu bằng cách giảm hấp thu ở ruột và t ng bài tiết cholesterol trong phân và acid mật (Hosomi và cộng sự, 2011). Nó cũng đã đƣợc báo cáo rằng thủy phân protein cá làm giảm hoạt động của acyl-CoA: cholesterol acyltransferase, một loại enzyme cần thiết để chuyển đổi cholesterol tự do thành cholesterol ester trong enterocyte sau khi hấp thụ để cholesterol đƣợc tiết ra bên ngoài vào hệ thống bạch huyết và sau đó vào d ng máu (Wergedah và
44
cộng sự, 2004). Hơn nữa, protein cá làm giảm khả n ng h a tan của cholesterol trong các mixen, giúp chuyển cholesterol trong ruột non qua lớp nƣớc khơng đóng cặn đến biểu mơ ruột để hấp thụ (Hosomi và cộng sự, 2011). Cũng trong nghiên cứu thấy rằng, fish protein hydrolysate từ cá tra kiểm soát tốt hơn whey protein concentration các chỉ số chất béo trong máu. Điều này có thể giải thích bởi thành phần amino acid trong hai loại protein do một nghiên cứu gần đây cho thấy các peptide có nguồn gốc từ cá ảnh hƣởng có lợi đến các con đƣờng liên quan đến việc kiểm soát thành phần cơ thể, cấu trúc lipid và điều hịa chuyển hóa glucose (Dale và cộng sự, 2019). Theo phụ lục 3, hàm lƣợng methionine trong whey protein cao hơn trong FPH (0,0194 > 0,0108), methionone có xu hƣớng làm t ng cholesterol. Glycine và cystein làm giảm nồng độ cholesterol, do cysteine là tiền chất của taurine, chính vì vậy khi cơ thể hấp thu một lƣợng lớn cysteine có thể làm t ng hàm lƣợng taurine cũng nhƣ làm giảm cholesterol trong cơ thể. Cũng theo phụ lục 3, hàm lƣợng Arginine trong FPH cao hơn Whey (0,302 > 0,022), đây là amino acid đã đƣợc chứng minh là có khả n ng gây ra sự giải phóng insulin thơng qua việc điều h a các protein đặc biệt (Thams và Thams, 1999).
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng giống với các nghiên cứu trƣớc đây chẳng hạn, (Nora Benaicheta và cộng sự, 2015) cho chuột n protein cá hồi và đã cải thiện đáng kể các chỉ số chất béo. Hay (Wang và cộng sự, 2019) cũng sử dụng chế phẩm protein tƣơng tự chúng tôi Herring Milt Protein Hydrolysate và cho kết quả giảm đáng kể cholesterol toàn phần, triglyceride, LDL và t ng HDL trong máu. Từ những nhận xét và kết quả đó có thể rút ra đƣợc fish protein hydrolysate từ cá tra giàu giá trị dinh dƣỡng (thành phần amino acid) và kiểm soát tốt đƣợc các chỉ số chất béo trong cơ thể.
45
Bảng 3. 3. Bảng các chỉ số acid uric và insulin của các nhóm chuột thí nghiệm.
Ảnh hƣởng lên chỉ tiêu acid uric trong máu: Dựa vào bảng 3.3, kết quả có sự khác biệt rõ rệt giữa các nhóm thí nghiệm về chỉ tiêu acid uric. Nhóm sử dụng protein với hàm lƣợng cao trong khẩu phần n (HW-HF và HP-HF) có chỉ số acid uric cao hơn trong số 6 nhóm thí nghiệm. Tuy nhiên các nhóm vẫn có chỉ số acid uric ở mức an toàn < 5,6 mg/dl (Kim, 2012) kết hợp với hình ảnh cấu trúc mô thận và phụ lục 6. Kết luận rằng protein trong từng khẩu phần n khảo sát khác nhau không ảnh hƣởng lớn đến chỉ số axit uric trong máu.
Ảnh hƣởng lên chỉ số insulin trong máu: : Dựa vào bảng 3.3, kết quả khơng có sự khác biệt rõ rệt giữa các nhóm thí nghiệm về chỉ tiêu insulin trong máu. Điều này do mơ hình thử nghiệm chúng tôi sử dụng là đái tháo đƣờng loại 2 nên chỉ số insulin dù ở mức bình thƣờng vẫn khơng kiểm sốt đƣợc lƣợng đƣờng huyết t ng cao trong cơ thể.
4. H nh thái giải phẫu mơ gan, thận, mỡ
Nhóm Acid uric (mg/dl) Insulin (µU/ml) Tuần 0 5,12f <0,4b Tuần 7 C 3,38d 0,1a C – HF 2,16b 0,1a MW – HF 2,01a 0,1a HW – HF 5,02e 0,1a MP – HF 2,78c 0,1a HP – HF 5,50g 0,1a
* Các giá trị trong biểu đồ biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 7)
Các giá trị có ký hiệu khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có nghĩa về mặt thống kê (p<0,05).
46
A B
C D
E F
Chú thích: T: Tĩnh mạch trung tâm; G: Các tế bào gan bình thường; M1: Các hạt mỡ to;
M2: Các hạt mỡ nhỏ xung quanh nhân tế bào. (A): Tế bào gan của nhóm C
(B): Tế bào gan của nhóm C – HF (C): Tế bào gan của nhóm MW – HF (D): Tế bào gan của nhóm HW – HF (E): Tế bào gan của nhóm MP – HF (F): Tế bào gan của nhóm HP – HF
Hình 3. 5. Vi phẫu gan ở các nhóm chuột thí nghiệm nhuộm Hematoxylin và Eosin đƣợc
quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng đại 10 lần.
T G
M1 M2
47
Dựa vào hình ảnh cấu trúc vi phẫu gan có thể nhận xét, nhóm đối chứng C-HF (Hình (B)) so với nhóm đối chứng C (Hình (A)) có sự khác biệt rõ rệt về hình ảnh đại thể và vi thể. Với kích thƣớc đại thể, gan nhóm đối chứng C có bề mặt trơn láng, mềm, mịn và có màu đỏ sậm, khơng có mơ gan nào bị tổn thƣơng hoặc phình to. Với kích thƣớc vi thể, nhóm đối chứng C có các tế bào gan tr n đều, xếp khít nhau tạo thành các dãy tế bào gan hƣớng tĩnh mạch trung tâm, không xuất hiện các hạt mỡ nhỏ xung quanh nhân tế bào gan. Gan nhóm đối chứng C-HF (Hình (B)) mang hình ảnh đại thể có bề mặt nh n, màu vàng sáng xuất hiện nhiều lốm đốm và gan phình to lên. Cấu trúc vi thể nhóm C-HF cho thấy gan bị thối hóa mỡ nghiêm trọng với hình dạng tế bào gan khơng cịn rõ ràng, nhân tế bào bị đẩy lệch sang một do mỡ quá nhiều đồng thời xuất hiện nhiều tổn thƣơng trên gan bao gồm (hoại tử quanh khoảng cửa, hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm, hoại tử trong tiểu thùy, viêm quanh khoảng cửa). Kết quả cuối cùng theo phụ lục (5) cho thấy nhóm đối chứng C-HF bị viêm gan (HAI Score): 12/18. Từ đó kết luận đƣợc rằng việc sử dụng khẩu phần n giàu béo đã t ng nguy cơ mắc bệnh gan nhiễm mỡ hay viêm gan do q trình tích tụ mỡ trong gan.
So sánh hình ảnh đại thể và vi thể hai nhóm sử dụng whey protein (MW-HF hình (C), HW-HF hình (D)) với hai nhóm đối chứng ta nhận xét rằng. Bề mặt gan khơng cịn đƣợc trơn láng, có màu vàng nhạt, xuất hiện lốm đốm và gan phình lên nhƣng khơng to bằng gan nhóm đối chứng C-HF. Hình ảnh vi thể cho thấy cả hai nhóm sử dụng whey protein đều xuất hiện nhiều các hạt mỡ xung quanh nhân tế bào gan. Nhóm HW-HF (hình (C)) xuất hiện thêm những hạt mỡ to so với hình ảnh tiêu bản nhóm đối chứng C dẫn đến một số tế bào có nhân bị đẩy lệch một bên. Kết quả cuối cùng theo phụ lục (5) cho thấy nhóm HW-HF hoại tử trong tiểu thùy (1/4), viêm gan mức độ tối thiểu 1/18 và nhóm MW- HF với mơ gan rải rác có hiện tƣợng thối hóa mỡ < 5%. Từ nhận xét và kết quả cho thấy việc sử dụng khẩu phần n giàu béo tiêu chuẩn có whey protein concentration làm nguồn protein nhƣng vẫn khơng kiểm sốt đƣợc bệnh gan nhiễm mỡ ở chuột.
So sánh hình ảnh đại thể và vi thể hai nhóm sử dụng Fish protein hydrolysate từ cá tra (MP-HF hình (E) và HP-HF hình (F)) với hai nhóm đối chứng và với hai nhóm sử dụng whey protein, ta nhận xét rằng. Với hình ảnh đại thể, hai nhóm sử dụng protein trong nghiên cứu tuy bề mặt không trơn láng mềm mịn và màu đỏ sậm nhƣ gan của nhóm đối chứng C nhƣng khơng có hiện tƣợng phình to, khơng xuất hiện lốm đốm, có màu đỏ nhạt. Hình ảnh vi thể cho thấy có xuất hiện các hạt mỡ nhỏ xung quanh nhân tế bào gan nhƣng
48
tần suất rất ít, các tế bào gan vẫn tr n đều, nhân tế bào gan vẫn sắp xếp không bị lệch một bên. Kết quả cuối cùng theo phụ lục (5) cho thấy gan cả hai nhóm MP-HF và HP-HF đều bình thƣờng và khơng xuất hiện các tổn thƣơng trên gan.
Việc n khẩu phần giàu chất béo theo tiêu chuẩn là nguyên nhân chính gây bệnh gan nhiễm mỡ khơng do rƣợu (NAFLD) vì cơ thể tích tụ q nhiều triglyceride (TG) thông qua việc hấp thụ nhiều acid béo trong thức n, acid béo t ng lƣu thông trong cơ thể làm t ng nguy cơ phân giải lipid trong các tế bào dẫn đến rất nhiều acid béo đƣợc lƣu trữ trong các mô gan. Điều này đƣợc chứng minh trong nghiên cứu của (Nora và cộng sự, 2015). Tuy nhiên theo nghiên cứu, khẩu phần n có chế phẩm Fish protein hydrolysate (FPH) đã giúp cải thiện rất nhiều tình trạng bệnh NAFLD. Có thể giải thích trong FPH giàu thành phần amino acid taurine và glycine làm t ng nồng độ acid mật trong huyết tƣơng đồng thời giảm lipid gan, ngoài ra taurine làm giảm mức TAG dự trữ trong gan (Shirai và takeda, 2002). Kết quả này cũng giống với kết quả nghiên cứu trƣớc đây đối với một loại protein cá hồi của (Nora và cộng sự, 2015) và Yellow fish protein hydrolysate của (Kim và cộng sự, 2017). Từ nhận xét giải thích và kết quả cho thấy việc sử dụng khẩu phần n giàu béo theo tiêu chuẩn có Fish protein hydrolysate từ cá tra làm nguồn protein đã kiểm soát tốt đƣợc bệnh gan nhiễm mỡ ở chuột.
49
A B
C D
E F
Chú thích: 1 - Tiểu cầu thận; 2 - Mao mạch tiểu cầu thận; 3 - Khoang Bowman
(A): Tế bào thận của nhóm C (B): Tế bào thận của nhóm C – HF (C): Tế bào thận của nhóm MW – HF (D): Tế bào thận của nhóm HW – HF (E): Tế bào thận của nhóm MP – HF (F): Tế bào thận của nhóm HP – HF.
Hình 3. 6. Vi phẫu gan ở các nhóm chuột thí nghiệm nhuộm Hematoxylin và Eosin đƣợc
quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng đại 10 lần.
1 3
50
Dựa vào hình ảnh cấu trúc vi phẫu thận nhƣ trên và kết quả phân tích vi phẫu mơ thận ta nhận xét rằng. Nhóm C-HF (Hình (B)), nhóm sử dụng whey protein (MW-HF và HW-HF hình (C) và (D)). Đều cho kết quả mơ thận có hiện tƣợng thấm nhập nhiều lymphô bào, tƣơng bào trong mô k và quanh ống thận, bể thận kèm rải rác có các ống thận bị phá hủy. Kết luận ba nhóm có hiện tƣợng viêm thận – bể thận mạn tính, mức độ nh . Riêng nhóm đối chứng C-HF so với nhóm đối chứng C có sự gia t ng đáng kể các ống thận bị thối hóa có thể do sự lắng đọng của các giọt lipid dƣ thừa ở chuột bi bệnh. Tuy nhiên có thể giải thích rằng việc n thực phẩm giàu chất béo dẫn đến đƣờng huyết trong máu t ng, gan nhiễm mỡ (NAFLD), tiến triển đến tình trạng béo phì. Từ đó khối lƣợng thận cũng t ng lên theo bảng (3.5) kết hợp với giải thích theo (Kim và cộng sự, 2017) là do sự gia t ng nồng độ creatinine và BUN trong huyết thanh hay còn gọi là bệnh thận (Nephropathy). BUN là lƣợng ure nitrogen trong máu (sản phẩm chuyển hóa protein). Mức BUN cao gây ra bệnh thận. Creatinine huyết thanh t ng gây tình trạng giảm mức lọc của cầu thận (Sodikoff, 2001). Trong nghiên cứu này, nhƣng con chuột C-HF có sự gia t ng r rệt về khối lƣợng thân cùng với sự lắng đọng các giọt lipid liên quan đến sự hút chân khơng của ống thận. Với nhóm sử dụng protein trong nghiên cứu (MP-HF và HP-HF hình (E) và (F)), cho kết quả thận bình thƣờng khơng có hiện tƣợng viêm nào xảy ra. Kết quả này cũng giống với nghiên cứu trƣớc đây của (Kim và cộng sự, 2017) với đối tƣợng Yellow catfish protein hydrolysate. Từ đó có thể kết luận fish protein hydrolysate từ cá tra có tác dụng bảo vệ thân một cách thuận lợi.
Bên cạnh đó kết luận vi phẫu mơ thận của sáu nhóm cũng cho rằng khơng có phát hiện sỏi trên từng mẫu thử, khơng có dấu hiệu xuất hiện cặn uric acid trong tế bào. Kết hợp với chỉ số uric acid đo đƣợc của sáu nhóm theo bảng (3.3). Từ đó kết luận đƣợc. hàm lƣợng protein sử dụng trong sáu khẩu phần n không ảnh hƣởng đến chỉ số uric acid trong