CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3. Các phƣơng pháp phân tích thành phần hóa học
3.1. Phƣơng pháp phân tích ẩm
Hàm lƣợng ẩm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp AOAC 925.10.
3.2. Phƣơng pháp phân tích chất khơ
Từ kết quả phân tích ẩm bằng phƣơng pháp AOAC 925.10 suy ra kết quả hàm lƣợng chất khô.
3.3. Phƣơng pháp phân tích chất béo
Hàm lƣợng chất béo đƣợc xác định bằng phƣơng pháp AOAC 920.39.
3.4. Phƣơng pháp phân tích protein tổng
Hàm lƣợng protein đƣợc xác định bằng phƣơng pháp AOAC 984.13.
4. Giá trị dinh dƣỡng của fish protein hydrolysate PH) trong các khẩu phần ăn
27 42 con chuột đực C ( Control) C-HF (Control-High Fat) HW-HF (High Whey- High Fat) MW-HF (Medium Whey-High Fat) HP-HF (High Protein- High Fat) MP-HF (Medium Protein–High Fat)
Chuột thích nghi mơi trƣờng mới (1 tuần)
Khẩu phần n thích nghi
Cân đầu vào (Ngày 0)
Cho n khẩu phần n thích hợp (Bảng 2.1) (7 tuần)
Cân khối lƣợng chuột m i tuần
Cân trƣớc khi giải phẫu
Đo các chỉ tiêu:
Đƣờng huyết cấp tính, insulin, uric acid
Triglycerrid, Cholesterol HDL-,LDL-Cholesterol, men gan (AST,ALT)
Giải phẫu:
- Lấy máu tĩnh mạch chủ
- Thu nhận nội tạng (gan, thận, mỡ bụng)
Thu nhận tiêu bản soi dƣới kính hiển vi (Mơ gan, thận, mỡ bụng)
Cho nhịn n 16h
Hình 2. 2. Sơ đồ khảo sát dinh dƣỡng in vivo của một số nhóm thí nghiệm với các khẩu phần
28
Bảng 2. 1. Thành phần sáu khẩu phần n của sáu nhóm chuột thí nghiệm.
Thành phần Sáu nhóm thí nghiệm C C - HF MW – HF HW – HF MP – HF HP – HF Protein (g) 15 12,5 - - - - Whey protein (g) - - 14,54 41,54 - - Fish Protein Hydrolysate (g) - - - - 14,54 41,54 Carbohydrate1 (g) 54 45 58,00 28,45 58,00 28,45 Chất béo2 (g) 10 25 25 25 25 25 Chất xơ3 (g) 7 5,83 5,16 5,16 5,16 5,16 Vitamin& chất khoáng4 (g) 4 4 4,5 4,5 4,5 4,5 Choline bitartrate5 (g) - - 0,5 0,5 0,5 0,5 N ng lƣợng (Kcal) 3,66 4,55 4,85 4,85 4,85 4,85
C: Control, C-HF: Control-High Fat, MW-HF: Medium Whey-High Fat, HW-HF: High Whey-High Fat, MP-HF: Medium Protein-High Fat, HP-HF: High Protein-High Fat. 1Tinh bột sắn làm nguồn carbohydrate trong khẩu phần, 2Nguồn mỡ bò với hàm lượng axit béo dạng trans giàu hơn mỡ heo (Enser
và cộng sự, 1995)., 3 Nguồn Carboxymethyl Cellulose (CMC), xuất xứ Trung Quốc, 4 Nguồn Berocca Perfornmance Orange, 5Nguồn Choline Bitartrate Dietary Supplement, Douglas Laboratorie.
Bốn mƣơi hai c n chuột đực (n = 7 con/nhóm) đƣợc mua tại viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, khơng có mầm bệnh đƣợc cho n chế độ n thích nghi (theo tiêu chuẩn AIN- 93) trong vịng một tuần trƣớc thí nghiệm. Với điều kiện m i lồng nuôi gồm 7 con, nhiệt độ (20 - 25˚C) và độ ẩm (40 - 45 ), đƣợc kiểm soát chu kỳ sáng tối là 12h : 12h (Kim và cộng sự, 2017).
Bắt đầu tuần thí nghiệm đầu tiên, chia thành 6 nhóm cho n các khẩu phần n khác nhau. Hai mƣơi tám con chia làm 4 nhóm cho n chế độ nhiều chất béo (25% chất béo trong khẩu phần n). Trong 4 nhóm này bao gồm 2 nhóm sử dụng Whey protein concentrate trong khẩu phần, 2 nhóm sử dụng Fish protein hydrolysate (FPH) trong khẩu phần. Bảy con chuột nhóm đối chứng C cho n khẩu phần theo tiêu chuẩn AIN-93. Bảy con chuột nhóm đối chứng C-HF cho n khẩu phần n theo tiêu chuẩn AIN-93 có bổ sung thêm mỡ đến 25% trong thành phần. Thời gian nuôi kéo dài bảy tuần. Trong q trình ni, chuột đƣợc cung cấp nƣớc uống tự do (nƣớc vô trùng), khẩu phần n m i ngày đƣợc cân khối lƣợng chính xác, thức n dƣ thừa m i ngày cũng đƣợc cân lại khối lƣợng để xác định lƣợng caloride tiêu thụ. Cân điện tử tự động (CAN-DT-MINI-R01) đƣợc sử dụng để cân khối lƣợng chuột và khối lƣợng thức n (Kim và cộng sự, 2017). Việc tiêu thụ thực phẩm của từng nhóm chuột đƣợc theo d i hàng ngày để đánh gia khả n ng hấp thụ n ng lƣợng. Chuột cũng đƣợc cân hàng tuần để đánh giá khối lƣợng cũng nhƣ tốc độ sinh trƣởng của từng nhóm chuột (Wang và cộng sự, 2019). Kết thúc thí nghiệm chuột đƣợc ngừng
29
cung cấp thức n trong 16 giờ trƣớc khi cân trọng lƣợng lần cuối và tiến hành các phƣơng pháp đó các chỉ tiêu ( đƣờng huyết, cholesterol, uric acid). Tiến hành giải phẫu chuột để lấy máu, gan, thận, mô mỡ làm tiêu bản mơ để quan sát.
Tùy theo từng nhóm thí nghiệm chỉ thay đổi tỉ lệ giữa protein, carbohydrate và chất béo. Vì các khẩu phần n trên đƣợc xây dựng dựa trên khẩu phần n tiêu chuẩn theo hƣớng dẫn của AIN-93.
Mức độ tin cậy của cỡ mẫu đƣợc tính theo cơng thức (Jaykaran Charan, 2013): E = Tổng số lƣợng động vật – Tổng số nhóm Jaykaran Charan, 2013
Giá trị E nên nằm giữa 10 – 20. Nếu E < 10 thì cần t ng số lƣợng động vật nhằm thu đƣợc kết quả có độ tin cậy cao. Nếu E > 20 thì khơng cần t ng số lƣợng nữa, kết quả đạt có độ tin cậy cao. Phƣơng pháp này áp dụng cho tất cả các thí nghiệm trên động vật (Jaykaran Charan, 2013). Trong thí nghiệm của chúng tơi, E = 42 - 7 = 36 >20 nên kích cỡ mẫu đạt yêu cầu.
Ngoài ra, theo các nguyên tắc khi sử dụng động vật trong thử nghiệm đƣợc nêu ra bởi (Kolar, 2006), trong đó có nguyên tắc giảm số lƣợng động vật đƣợc sử dụng trong thí nghiệm nhƣng vẫn có đƣợc thơng tin chính xác nhất định. Trong nghiên cứu của (Nasri và cộng sự, 2015) sử dụng mơ hình nghiên cứu với sáu nhóm chuột khảo sát m i nhóm (n= 6 con/nhóm). Do đó, việc xác định cỡ mẫu của chúng tôi trong nghiên cứu này là hoàn toàn hợp lý.
Bảng 2. 2. Bảng mã hóa mẫu thí nghiệm.
Tên mã hóa Chú thích
C Nhóm n khẩu phần n Control
C – HF Nhóm n khẩu phần n Control bổ sung thêm chất béo hàm lƣợng cao
MW – HF Nhóm n khẩu phần n có hàm lƣợng whey trung bình và hàm lƣợng chất
béo cao
HW – HF Nhóm n khẩu phần n có hàm lƣợng whey cao và hàm lƣợng chất béo cao
MP – HF Nhóm n khẩu phần n có hàm lƣợng FPH trung bình và hàm lƣợng chất
béo cao
HP – HF Nhóm n khẩu phần n có hàm lƣợng FPH cao và hàm lƣợng chất béo cao
5. Đo khối lƣợng chuột
Cân nặng của chuột đƣợc quan sát và đo vào m i tuần. Toàn bột số chuột trong các nhóm đều đƣợc đo khối lƣợng. Cân nặng của chuột đƣợc đo bằng cân điện tử (CAN-DT- MINI-R01). Một cái hộp đƣợc đặt lên cân và hiệu chỉnh. Sau đó đặt chuột nh nhàng vào hộp. Ghi lại số liệu hiển thị trên máy khi chuột đã giữ cân bằng.
30
Hình 2. 3. Cách cân chuột trong thí nghiệm in vivo.
* Cơng thức tính tốc độ tăng trƣởng trung bình của từng nhóm chuột qua các
tuần thì nghiệm (R):
R =
(2.2) Trong đó:
mi là khối lƣợng trung bình của từng chuột ở tuần i
m0 là khối lƣợng trung bình của từng chuột ở ngày nuôi đầu tiên (ngày 1)
* Công thức tính tỷ lệ giữa cân nặng và năng lƣợng tiêu thụ trung bình của từng nhóm chuột qua các tuần thì nghiệm (T):
T = (2.3) Trong đó:
mi là khối lƣợng trung bình của từng chuột ở tuần i
m0 là khối lƣợng trung bình của từng chuột ở ngày ni đầu tiên (ngày 1) Ni là n ng lƣợngt tiêu thụ trung bình của từng nhóm chuột ở tuần i
31
6. Giải phẫu chuột thí nghiệm
Hình 2. 4. Mơ hình giải phẫu chuột (Gast, 2017).
Trƣớc khi giải phẫu, kéo dãn đốt sống lƣng để chuột khơng cịn cảm giác và khả n ng cử động. Chuột sau khi đã bất động đƣợc đặt ngửa lên và cố định 4 chi. Các bƣớc A, B, C lần lƣợt mở lồng ngƣợc và khoang bụng của chuột ra. Sau khi mở khoanh bụng s quan sát đƣợc nội tạng bên trong. Bƣớc D, E phục vụ cho việc lấy máu để đo các chỉ tiêu sinh hóa. Có thể dùng ống tiêm lấy trực tiếp từ tim chuột hoặc cắt đứt động mạch chủ cho máu tràn ra để dễ lấy máu. Sau khi đã lấy máu, các bƣớc còn lại F, G, H, I chuột đƣợc mở rộng khoang bụng hơn, bƣớc này nhằm lấy các nội tạng cần phân tích bên trong cơ thể chuột.
Formol 10 thƣờng sử dụng để bảo quản nội tạng động vật trong phịng thí nghiệm vì có tính khử trùng mạnh nên nó dùng làm tác nhân ng n chặn vi khuẩn xâm nhập, giúp mô và tế bào không bị phân hủy. Rửa các mẫu nội tạng bằng nƣớc muối 35 để làm sạch trƣớc khi ngâm formol. Việc bảo quản formol có thể kéo dài thời gian bảo quản lên đến rất lâu. Cần thay dịch formol 4 ngày/1 lần bởi dịch lúc này đã có sự nhiễm bẩn.
32
7. Nhuộm tiêu bản
Có nhiều phƣơng pháp làm tiêu bản để nghiên cứu trong đó phƣơng pháp làm tiêu bản hiển vi cố định và nhuộm màu là phƣơng pháp phổ biến dùng trong xét nghiệm mẫu bệnh so với mẫu đối chứng. Phƣơng pháp này nhằm tạo đƣợc những mảnh mỏng, trong suốt của mô ở cơ quan, cho phép quan sát đƣợc dƣới kính hiển vi dễ dàng thấy đƣợc nhân tế bào, tế bào chất. Thêm vào đó tiêu bản s đƣợc nhuộm kép bằng Hematoxylin và Eosin Y, các phần tiêu bản có màu sắc khác nhau giúp cho việc quan sát dễ dàng. Cụ thể các thành phần có tính acid của tế bào bắt màu với thuốc nhuộm hematoxylin cho màu xanh tím. Eosin làm cho tế bào chất, mơ liên kết, collagen có màu hồng khi quan sát dƣới kính hiển vi.
Tiến hành bằng cách tách lấy một thùy nhỏ của gan chuột thí nghiệm ngâm trong dung dịch formol 10% ít nhất 24 giờ, xử lý và tiến hành tẩm paraffin-xylen, đúc khuôn theo qui trình thực hiện tiêu bản mơ học của (Saalu và cộng sự, 2012) có hiệu chỉnh. Mẫu đƣợc cắt bằng microtome thành các lát cắt có độ dày 5 µm, khử paraffin, nhuộm với Hematoxylin và Eosin, quan sát dƣới kính hiển vi để đánh giá mô học.
8. Đo các chỉ tiêu sinh hóa
8.1. Đo đƣờng huyết cấp tính (Oral Glucose tolerance test)
Thí nghiệm đo đƣờng huyết cấp tính giúp xác định sự ảnh hƣởng của các thành phần hóa học (Protein, lipid, carbohydrate,..) trong cá tra ảnh hƣởng đến chuyển hóa glucose. Để đánh giá khả n ng dung nạp glucose và kiểm tra cân bằng nội môi glucose đối với động vật thử nghiệm (Ibrahim và cộng sự, 2011). Theo (Wang và cộng sự, 2019), các xét nghiệm đƣờng huyết đƣợc thực hiện bằng cách bơm glucose 7,5% (w/v) trực tiếp vào đƣờng uống với liều lƣợng 0,5 ml cơ thể sau 16 giờ nhịn n. Nồng độ glucose trong máu đƣợc đo từ việc lấy máu trong tĩnh mạch đuôi ở 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 và 240 phút bằng máy đo Accu-Chek (Roche Diagnostics, Toronto, ON, Canada) (phạm vi đo 10-600
mg/dL hoặc 0,6-33,3 mmol/L). Diện tích đƣợc tạo ra dựa trên đƣờng cong của đồ thị đƣờng
huyết s đƣợc tính tốn và sử dụng nhƣ một tham số để đánh giá khả n ng dung nạp glucose trực tiếp bằng đƣờng uống.
33
Hình 2. 5. Bơm trực tiếp glucose vào dạ dày chuột.
Quy trình lấy máu tĩnh mạch đuôi tiến hành nhƣ sau: Các yêu cầu bao gồm có động vật thí nghiệm, g ng tay xử lý động vật gặm nhấm, kh n, bông, ống lấy mẫu. Động vật đƣợc giữ thoải mái trong một bộ dụng cụ cố định, nhiệt độ duy trì khoảng 24 đến 27°C. Khơng nên cọ xát đi từ gốc đến ngọn vì nó s dẫn đến t ng bạch cầu. Nếu khơng nhìn thấy tĩnh mạch, có thể nhúng đi vào nƣớc ấm (40°C). Sử dụng kim 23G để chọc ven và máu đƣợc thu thập bằng ống mao dẫn hoặc ống tiêm có kim. Trong trƣờng hợp gặp khó kh n, có thể mở 0,5 đến 1 cm bề mặt da tại vị trí tĩnh mạch, chích tĩnh mạch cho chảy máu và máu đƣợc thu thập bằng ống mao dẫn hoặc ống tiêm có kim. Khi hồn thành việc lấy máu, sử dụng thuốc mỡ hoặc dung dịch chứa bạc / hoặc ấn và giữ nh để cầm máu (Hoff, 2000). Để tránh bầm tím và tổn thƣơng đi, thông thƣờng không nên lấy quá tám mẫu máu m i phiên và trong một khoảng thời gian 24 giờ bất kỳ. Số lần thử lấy mẫu máu phải đƣợc giảm thiểu (không quá ba que kim trong một lần thử) và phải có đủ thời gian để đuôi phục hồi giữa các lần lấy mẫu máu (Theo tổ chức NC3R).
34
Hình 2. 6. Các bƣớc lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột.
8.2. Đo các chỉ số sinh hóa khác (mỡ máu, uric acid, insullin)
Máu đƣợc lấy từ động mạch chủ của chuột đƣợc sử dụng để đo các chỉ số nhƣ tổng số cholesterol (TC), lipoprotein mật độ thấp (LDL), triglycerid (TG), lipoprotein mật độ cao (HDL), uric acid, insulin. (Kim và cộng sự, 2017).
Mẫu máu đƣợc lấy trực tiếp từ tim sau khi mổ chuột, cho vào eppendorf có bổ sung chất chống đồng rồi chuyển đến bệnh viện Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch thành phố Hồ Chí Minh để phân tích các chỉ số nhƣ trên. Hoặc các chỉ số sinh hóa đƣợc đo trực tiếp bằng bộ Kit để tìm các chỉ tiêu nhƣ uric acid, HDL, LDL và Cholesterol tổng.
Quy trình lấy máu tim tiến hành nhƣ sau. Các yêu cầu bao gồm: động vật thí nghiệm, chất gây mê, kh n, bông, kim 19 đến 25G với ống tiêm 1 đến 5 ml, lƣỡi dao phẫu thuật, ống (đƣờng kính trong 0,1 đến 0,3 mm) để phẫu thuật lồng ngực, túi nhựa dùng một lần và ống lấy mẫu máu. Việc chọc thủng tim đƣợc khuyến nghị cho giai đoạn cuối của nghiên cứu để thu thập một lƣợng máu duy nhất, chất lƣợng tốt và khối lƣợng lớn từ các động vật thí nghiệm. Kim thích hợp đƣợc sử dụng để thu thập mẫu máu có hoặc khơng
35
kèm mở ngực. Mẫu máu s đƣợc lấy từ tim, tốt nhất là từ tâm thất, lấy từ từ để tránh x p tim (Theo tổ chức NC3R). Chú ý: Nếu động vật có tật tim lệch phải, lấy mẫu có thể thất bại.
Hình 2. 7. Cách lấy máu tĩnh mạch ở tim chuột (Parasuraman và cộng sƣ, 2010).
Hình 2. 8. Máy đo chỉ tiêu sinh hóa máu Beckman Coulter Olympus và Diasorin Liaison
36
9. Đo khối lƣợng nội tạng
Khối lƣợng của các nội tạng quan trọng ( gan,, thận, mỡ bụng) đƣợc đo ngay sau khi thực hiện giải phẫu chuột để lấy nội tạng (Kim và cộng sự, 2017). Có khối lƣợng nội tạng s tính đƣợc mối quan hệ giữa khối lƣợng nội tạng với khối lƣợng cơ thể ( khối lƣợng gan so với khối lƣợng cơ thể (%), khối lƣợng thận so với khối lƣợng cơ thể (%) và khối lƣợng mỡ bụng so với khối lƣợng cơ thể (%)).
10. Phƣơng pháp thống kê
M i kết quả đƣợc đƣa ra bao gồm độ lệch chuẩn và giá trị trung bình. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm đƣợc tính bằng ONE-WAY ANOVA (SAS Institute, Cary, NC, USA) và các nhóm đƣợc coi là khác biệt với p < 0,05 khi đƣợc xác định bằng cách sử dụng Trắc nghiệm đa đoạn Duncan (Duncan’s multiple range test).
37
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Thành phần của PC và FPH
Quá trình xử lý tạo FPC và FPH phải đạt hiệu suất thu hồi cao, phải cho ra đƣợc sản phẩm có hàm lƣợng protein cao (khoảng 80%), tỉ lệ các AA phải phù hợp với nhu cầu dinh dƣỡng của con ngƣời cũng với hàm lƣợng chất béo thấp (FAO).
Bảng 3. 1. Thành phần hóa học của FPC và FPH cá tra.
Thành phần FPC FPH Hiệu suất, 8,7a 1,02b Độ ẩm, 8 14 Chất khô, 92 86 Chất béo* , % 0,58 <0,1 Protein tổng, 90 84 a
là hiệu suất tạo thành FPC (g) trên 1kg fillet cá tra đã loại bỏ xương, mỡ, da và mạch máu.
b
là hiệu suất tạo thành FPH (g) trên 1g FPC.
* được phân tích bởi cơng ty TNHH EUROFINS Sắc Ký Hải Đặng
Thành phần hóa học của mẫu FPC nghiên cứu đƣợc so sánh với tiêu chuẩn của FAO. Từ kết quả thu đƣợc (Bảng 3.1), cho thấy bột FPC có hàm lƣợng protein và hàm lƣợng chất béo đạt yêu cầu loại A của FAO ( hàm lƣợng protein ≥ 80 , hàm lƣợng chất béo < 0,75%). FPC và FPH thu đƣợc đều có hàm lƣợng protein cao, thích hợp làm nguồn cung cấp đạm chủ yếu cho con ngƣời.
2. Giá trị dinh dƣỡng của fish protein hydrolysate (FPH) trong các khẩu phần ăn
khác nhau
38
Các giá trị trong biểu đồ biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 7)
Hình 3. 1. Sự t ng khối lƣợng của 6 nhóm chuột nghiên cứu.
Hình 3. 2. N ng lƣợng trung bình cung cấp cho một con chuột của m i nhóm qua 7 tuần
thí nghiệm. 30 35 40 45 50 0 1 2 3 4 5 6 7 C C - HF