Chương 1 : TỔNG QUAN
1.5. Cỏc phương phỏp nghiờn cứu tỏc dụng trờn chức năng sinh dục – sinh
1.5.1. Phương phỏp nghiờn cứu hành vi tỡnh dục trờn động vật thực nghiệm
Cú 2 mụ hỡnh thực nghiệm nghiờn cứu tỏc dụng của thuốc trờn hoạt động tỡnh dục, đú là test hành vi tỡnh dục (sexual behaviour test) và test ham muốn tỡnh dục (test for libido) [76].
* Test hành vi tỡnh dục
Chuột cống đực và cỏi trưởng thành, được nuụi trong điều kiện nhiệt độ, độ ẩm thớch hợp, chu kỳ sỏng tối được đảo ngược nhõn tạo. Chuột cống cỏi được gõy động dục nhõn tạo. Chuột đực được làm quen với test hành vi tỡnh dục trong cỏc đợt huấn luyện, mỗi đợt cỏch nhau 4 ngày. Cỏc thụng số quan sỏt gồm: MF, ML, IF, IL, EL, PEI [77],[78]. Trong 4 đợt huấn luyện cuối cựng, chỉ những chuột cú hoạt động tỡnh dục kộm (khụng hoàn thành ớt nhất 1 test sàng lọc) mới được đưa vào nghiờn cứu. Thuốc đối chiếu cú thể là sildenafil hoặc testosteron. Thử nghiệm được tiến hành như trong test huấn luyện vào ngày cuối cựng của đợt điều trị trong cựng phũng thớ nghiệm. Quan sỏt, ghi lại và so sỏnh chỉ số hành vi tỡnh dục giữa cỏc lụ [77],[78].
* Test ham muốn tỡnh dục
Sự ham muốn tỡnh dục cú thể phỏt sinh do cơ quan sinh dục bị kớch thớch hoặc khi cú sự kớch thớch bởi nghe, nhỡn, ngửi mựi đối tượng khỏc giới. Khi gõy tờ dương vật, cảm giỏc tại cơ quan sinh dục khụng cũn, do đú làm mất đi sự ham muốn được mang đến bởi cảm giỏc tại cơ quan sinh dục. Test ham muốn tỡnh dục là một thử nghiệm để đỏnh giỏ tỏc dụng của thuốc trờn lũng ham muốn tỡnh dục nội tại, được phản ỏnh qua chỉ số ML, MF [76].
Chuẩn bị, huấn luyện chuột, chọn chuột, chia lụ và cho uống thuốc như trờn. Thử nghiệm được tiến hành vào ngày cuối cựng của đợt điều trị. Bộc lộ dương vật bằng cỏch thụt màng bao dương vật và bụi mỡ xylocain 5% vào dương vật tại cỏc thời điểm 30 phỳt, 15 phỳt và 5 phỳt trước khi bắt đầu cho giao phối. Cho mỗi con đực vào một chuồng quan sỏt, sau đú cho một con cỏi vào. Ghi lại cỏc chỉ số ML, MF và so sỏnh giữa cỏc lụ với nhau [76].
1.5.2. Cỏc phương phỏp nghiờn cứu chức năng cương dương trờn thực nghiệm
Cương dương là một mắt xớch cơ bản trong đời sống tỡnh dục của nam giới. Hiện nay, tỷ lệ nam giới bị rối loạn cương dương cú xu hướng ngày càng
tăng, do đú, cần thiết phải phỏt triển cỏc thuốc cú tỏc dụng điều trị rối loạn cương dương. Cỏc mụ hỡnh được trỡnh bày sau đõy cú thể dựng để nghiờn cứu tỏc dụng của thuốc trờn chức năng cương dương.
1.5.2.1. Test cương dương trờn động vật tỉnh
* Test cương trờn thỏ
Bỡnh thường khụng nhỡn thấy dương vật của thỏ. Khi dương vật cương mới quan sỏt thấy và cú thể đo được chiều dài dương vật. Thỏ đực trưởng thành khỏe mạnh được nuụi ớt nhất 1 tuần trước khi làm nghiờn cứu trong điều kiện phũng thớ nghiệm. Cho thỏ dựng thuốc. Giữ thỏ nhẹ nhàng trong một phũng yờn tĩnh, hạn chế mọi kớch thớch. Đo chiều dài dương vật (đoạn dương vật được lộ ra, khụng bị che bởi bao quy đầu) tại cỏc thời điểm 5, 10, 15, 30, 50, 60, 90, 120 phỳt sau khi dựng thuốc và tiếp tục như vậy đến khi hết khoảng thời gian nghiờn cứu (thời gian này thay đổi tựy theo tỏc dụng của từng thuốc thử) [79],[80].
* Test cương trờn chuột cống - Test cương khụng tiếp xỳc:
Trong thớ nghiệm cương khụng tiếp xỳc, chuồng quan sỏt được chia làm 2 nửa bằng một hàng rào hai lớp mắt lưới kim loại rộng 3 mm và cỏch nhau 2,5 cm. Hàng rào ngăn cản sự tiếp xỳc trực tiếp giữa con đực và con cỏi ở 2 bờn nhưng vẫn cho phộp chuột cú thể bị kớch thớch bởi nghe, nhỡn và ngửi mựi của con cỏi. Chuột đực được nhốt một mỡnh trong một bờn của chuồng quan sỏt trong 5 phỳt để làm quen, sau đú, chuột cỏi được đưa vào bờn kia chuồng, quan sỏt hiện tượng cương của con đực trong 30 phỳt. Sự cương được xỏc định khi con đực đứng lờn trờn gút 2 chõn sau, cỳi đầu về phớa vựng sinh dục và hụng chuyển động. Sau mỗi test cương khụng tiếp xỳc, rửa chuồng quan sỏt và hàng rào bằng chất tẩy rửa, làm khụ rồi mới thử chuột tiếp theo [81],[82].
- Test cương gõy ra bởi apomorphin:
Đặt chuột đực một mỡnh trong chuồng quan sỏt 5 phỳt để làm quen. Chuột được tiờm dưới da apomorphin liều 60 g/kg. Quan sỏt và ghi lại cỏc hiện tượng cương (erection, quick flip, long flip) trong 30 phỳt sau khi tiờm. Sự cương dương vật được ghi lại khi con chuột thể hiện hoạt động như trong test cương khụng tiếp xỳc [81],[82].
- Test cương phản xạ
Chuột được cố định trong một ống nhựa cú đường kớnh 8cm, dài 20cm trong 5 phỳt để làm quen. Sau đú co vỏ bao quy đầu và để lộ dương vật bằng một vũng kim loại lỏng. Đỏp ứng phản xạ được quan sỏt bằng mắt thường như sự kộo dài của thõn dương vật, sung huyết quy đầu và sự gập thõn dương vật. Test kộo dài trong 15 phỳt kể từ khi cú đỏp ứng đầu tiờn [81],[82].
Cỏc phương phỏp đỏnh giỏ chức năng cương được nờu trờn đõy cú nhược điểm là tớnh chớnh xỏc khụng cao do chịu ảnh hưởng nhiều bởi ngoại cảnh và chủ quan của người quan sỏt. Để khắc phục tỡnh trạng này, hiện nay, một phương phỏp được sử dụng phổ biến trờn thế giới để đỏnh giỏ tỏc dụng của một thuốc thử lờn chức năng cương dương là đo ỏp lực thể hang (ICP). Phương phỏp đo ỏp lực thể hang cú thể thực hiện trờn động vật gõy mờ hoặc trờn động vật tỉnh.
1.5.2.2. Đo ỏp lực thể hang (ICP)
6 Đo ICP trờn động vật gõy mờ
Khả năng cương của dương vật sau thời gian dựng thuốc được đỏnh giỏ dựa trờn ICP đo được sau khi kớch thớch dõy thần kinh hang bằng điện.
Chuột cống đực trưởng thành được phẫu thuật bộc lộ dõy thần kinh hang để kớch thớch điện, đặt catheter vào trong thể hang để đo ICP và đặt catheter vào động mạch cảnh để ghi huyết ỏp động mạch trung bỡnh. Gõy cương dương vật bằng cỏch kớch thớch điện dõy thần kinh hang và ghi lại ICP [81],[82],[83].
Cương dương là kết quả của sự tăng dũng mỏu trong thể hang. Do vậy, những tỏc nhõn dược lý cú khả năng làm tăng dũng mỏu thể hang đều cú thể làm tăng sự cương dương. Thuốc cú tỏc dụng tăng cường sự cương dương khi làm tăng giỏ trị ICP cực đại ở lụ thử so với lụ chứng [83].
Thuốc làm tăng dũng mỏu trong thể hang là do làm gión cơ trơn dương vật, do đú nú cú thể làm gión mạch và gõy giảm huyết ỏp động mạch trung bỡnh. Kớch thớch thần kinh thể hang bằng điện gõy giảm thoỏng qua huyết ỏp động mạch trung bỡnh, và gõy ra sự tăng ICP kộo dài ngay cả sau khi đó ngừng kớch thớch [83].
* Đo ICP trờn động vật tỉnh bằng kỹ thuật theo dừi từ xa
Trước khi can thiệp bằng thuốc, chuột đực được cấy bộ cảm biến cho phộp theo dừi ICP từ xa vào trong thể hang. Phương phỏp này cho phộp đo ICP trong test hành vi tỡnh dục, test cương khụng tiếp xỳc, test cương bởi apomorphin và test cương phản xạ mà khụng cần gõy mờ chuột [82].
Đo ICP bằng kỹ thuật theo dừi từ xa cung cấp số liệu cú giỏ trị và xỏc thực về ICP trong cỏc hoạt động giao cấu của chuột. Mụ hỡnh này cú ưu điểm hơn mụ hỡnh đo ICP bằng kớch thớch điện là chuột khụng bị gõy mờ, do đú cú thể ghi lại những diễn biến của ICP trong cỏc điều kiện hoạt động tự nhiờn. Tuy nhiờn, nhược điểm của mụ hỡnh là khú cú thể đưa thuốc vào trong thể hang chuột khi chuột đang hoạt động [66],[82].
1.5.2.3. Đo dũng mỏu chảy qua dương vật
Dựng siờu õm Doppler để đỏnh giỏ vi tuần hoàn dương vật, dũng mỏu chảy qua dương vật và đặc tớnh mạch mỏu ở dương vật, từ đú đỏnh giỏ tỏc dụng của thuốc trờn chức năng cương dương qua tỏc động lờn dũng mỏu chảy qua dương vật. Tốc độ dũng mỏu chảy qua dương vật được ghi lại và được so sỏnh giữa cỏc lụ. Phương phỏp này được dựng kết hợp với đo ICP bằng kớch thớch điện dõy thần kinh hang (ở chuột cống) hoặc co vỏ bao dương vật (ở
thỏ) [82],[84],[85]. Một thuốc cú tỏc dụng tăng cường chức năng cương dương khi làm tăng tốc độ dũng chảy trước và sau khi kớch thớch và làm giảm tốc độ dũng chảy trong quỏ trỡnh kớch thớch thần kinh hang để gõy cương cứng.
1.5.2.4. Nghiờn cứu trờn cơ trơn thể hang cụ lập
Động vật thường được sử dụng là thỏ, chuột cống. Cụ lập dải thể hang, nuụi trong bỡnh nuụi cơ quan cụ lập. Với thỏ, bỡnh nuụi cơ quan cụ lập chứa dung dịch đệm Tyrod ở 37oC, bóo hũa 95% O2 và 5% CO2 . Với chuột cống, bỡnh nuụi cơ quan cụ lập chứa dung dịch muối sinh lý đệm bởi HEPES (140mM NaCl, 5mM KCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, 5mM HEPES, 11mM glucose) với 100% O2 [82],[86]. Ghi lại hoạt động co, gión của cơ trơn thể hang dưới tỏc dụng của thuốc hoặc húa chất như phenylephrin, acetylcholin, isobutyl methylxanthien (IBMX) - một chất ức chế phosphodiesterase khụng chọn lọc hoặc GMP vũng [82],[86].
Nghiờn cứu này được thực hiện để tỡm hiểu cơ chế tỏc dụng của thuốc trờn cơ trơn thể hang. Thuốc làm gión cơ trơn thể hang cú thể do làm tăng giải phúng NO từ nội mụ mạch mỏu hoặc do ức chế enzym phosphodiesterase.
1.5.3. Cỏc phương phỏp nghiờn cứu vai trũ của hormon với hoạt động tỡnh dục trờn thực nghiệm
Androgen là hormon sinh dục nam, đúng vai trũ quan trọng trong chức năng sinh sản của nam giới. Nú cần thiết để hỡnh thành và duy trỡ cỏc đặc tớnh sinh dục nam thứ phỏt, ảnh hưởng đến khả năng sinh sản và hoạt động tỡnh dục. Vỡ vậy, thử hoạt tớnh androgen là một bước để sàng lọc và đỏnh giỏ tỏc dụng của thuốc trờn chức năng sinh sản nam.
Cỏc thử nghiệm về hoạt tớnh androgen phụ thuộc vào sự nhạy cảm của cỏc cơ quan sinh dục phụ loài gặm nhấm đực và cỏc cấu trỳc giới tớnh thứ cấp của chim và động vật cú vỳ đối với androgen. Trước đõy, cỏc nhà nghiờn cứu dựa vào đỏp ứng của mào gà trống choai thiến để đỏnh giỏ hoạt tớnh androgen.
Sau đú, cỏc nhà khoa học cú những cải tiến phương phỏp sử dụng chuột nhắt trắng, chuột cống trắng. Hiện nay, phương phỏp nghiờn cứu hoạt tớnh androgen phổ biến được sử dụng là nghiờn cứu ảnh hưởng trờn trọng lượng cơ quan sinh dục phụ của chuột cống đực. Cơ quan sinh dục phụ của chuột cống đực non rất nhạy cảm với androgen. Cú thể tiến hành trờn chuột cống đực non thiến hoặc chuột cống đực non cai sữa.
1.5.3.1. Nghiờn cứu hoạt tớnh androgen trờn chuột cống đực non thiến (Phương phỏp Hershberger)
Đõy là phương phỏp nhạy cảm, cú giỏ trị, đỏng tin cậy và được cho là một mụ hỡnh tốt để sàng lọc cỏc thuốc cú hoạt tớnh androgen cũng như khỏng androgen [87]. Chuột cống đực non 42-50 ngày tuổi, được thiến, cắt bỏ 2 tinh hoàn 2 bờn để loại trừ ảnh hưởng của androgen nội sinh, sau đú dựng thuốc nghiờn cứu. Thuốc chứng dương sử dụng là testosteron propionat, tiờm dưới da đựi với liều 0,4 mg/kg thể trọng/ngày. Thuốc nghiờn cứu dựng ớt nhất 2 liều [87]. Chỉ số nghiờn cứu chớnh bao gồm trọng lượng cỏc cơ quan sinh dục phụ (tỳi tinh, tuyến Cowper, cơ nõng hậu mụn – hành hang, tuyến tiền liệt, đầu dương vật). Thuốc nghiờn cứu được đỏnh giỏ là cú hoạt tớnh androgen khi làm tăng trọng lượng ớt nhất 2 cơ quan sinh dục phụ núi trờn [87].
1.5.3. 2. Nghiờn cứu hoạt tớnh androgen trờn chuột cống đực non cai sữa
Chuột cống đực non 20 - 34 ngày tuổi được cho dựng thuốc nghiờn cứu. Thuốc chứng dương sử dụng là testosteron propionat, tiờm dưới da đựi với liều 1,0 mg/kg thể trọng/ngày. Thuốc nghiờn cứu dựng ớt nhất 2 liều [87]. Chỉ số nghiờn cứu chớnh bao gồm trọng lượng cỏc cơ quan sinh dục phụ (mào tinh, tỳi tinh, tuyến Cowper, cơ nõng hậu mụn – hành hang, tuyến tiền liệt, đầu dương vật). Thuốc nghiờn cứu được đỏnh giỏ là cú hoạt tớnh androgen khi làm tăng trọng lượng ớt nhất 2 cơ quan sinh dục phụ núi trờn [87].
Bờn cạnh cỏc phương phỏp nghiờn cứu hoạt tớnh androgen trờn động vật thực nghiệm cũn cú cỏc phương phỏp nghiờn cứu hoạt tớnh androgen của thuốc in vitro như định lượng testosteron trong mỏu, nghiờn cứu ỏi lực gắn
của thuốc với androgen receptor, định lượng androgen receptor (AR) ở tuyến tiền liệt.
1.5.4. Cỏc phương phỏp nghiờn cứu ảnh hưởng của thuốc lờn hỡnh thỏi cơ quan sinh dục và khả năng sinh sản
1.5.4.1. Phương phỏp đỏnh giỏ trực tiếp trờn chuột cống đực
* Phõn tớch tinh trựng
Chuột cống đực trưởng thành được dựng thuốc nghiờn cứu trong một khoảng thời gian nhất định tựy vào mục đớch điều trị. Sau đợt điều trị, mổ chuột, phẫu tỏch tinh hoàn và cõn. Tỏch mào tinh ra để phõn tớch tinh trựng. Cỏc chỉ số phõn tớch gồm: mật độ tinh trựng, tỷ lệ tinh trựng sống/chết, khả năng di động của tinh trựng [89],[90].
* Đỏnh giỏ hỡnh thỏi tinh trựng
Ngoài ra, tinh trựng cũn được lấy để làm tiờu bản mụ học về hỡnh thỏi tinh trựng. Tiờu bản tinh trựng được nhuộm bằng kỹ thuật nhuộm papanicolaou: tinh trựng sau khi được lấy ra từ đuụi mào tinh được cố định trờn lam kớnh bằng dung dịch methanol 96%, sau đú nhuộm papanicolaou. Tiờu bản hỡnh thỏi tinh trựng được quan sỏt dưới kớnh hiển vi để xỏc định hỡnh thỏi và phỏt hiện những cấu trỳc bất thường ở đầu, cổ hay đuụi tinh trựng [89],[90].
* Đỏnh giỏ hỡnh thỏi tinh hoàn
Tinh hoàn được lấy để làm tiờu bản mụ học tinh hoàn, đỏnh giỏ chức năng sinh tinh của tinh hoàn. Tinh hoàn sau khi được phẫu tớch, cũn nguyờn cả vỏ bao, được cố định trong dung dịch formol đệm trung tớnh 10% và sử dụng kỹ thuật nhuộm Hematoxyline - Eosin (HE) để đỏnh giỏ hỡnh thỏi tinh hoàn. Tiờu
bản hỡnh thỏi tinh hoàn được quan sỏt dưới kớnh hiển vi để đỏnh giỏ thay đổi về cấu trỳc của biểu mụ tinh, ống sinh tinh, tuyến kẽ; số lượng, mật độ và kớch thước ống sinh tinh; số lượng cỏc tế bào dũng tinh [89],[90].
1.5.4.2. Phương phỏp đỏnh giỏ giỏn tiếp trờn sự mang thai của chuột cỏi
Chuột cống đực được dựng thuốc nghiờn cứu, sau đú cho ghộp đụi với chuột cống cỏi khụng dựng thuốc nghiờn cứu. Thụng thường, 1 chuột đực được ghộp đụi với 2 chuột cỏi. Qua đú, đỏnh giỏ giỏn tiếp chất lượng tinh trựng, hoạt động tỡnh dục và khả năng sinh sản của chuột đực thụng qua đỏnh giỏ cỏc chỉ số mang thai trờn chuột cỏi. Cựng với việc phõn tớch số lượng và chất lượng tinh trựng, nghiờn cứu trờn sự mang thai của chuột cỏi cho phộp khẳng định hơn nữa tỏc dụng của thuốc nghiờn cứu trờn khả năng sinh sản nam [89],[90].
Cỏc chỉ số nghiờn cứu mang thai của chuột cỏi bao gồm: tỉ lệ chuột cỏi cú thai, số hoàng thể, số thai đậu, số thai bỡnh thường, số mất trứng, số thai chết sớm, số thai chết muộn.