Chương 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.4. Phương phỏp nghiờn cứu
2.4.4. Đỏnh giỏ tỏc dụng của OS35 trờn hành vi tỡnh dục trờn chuột cống
trắng đực trưởng thành
Thớ nghiệm được tiến hành theo phương phỏp của Agmo (1997) [77], cụ thể như sau:
2.4.4.1. Giai đoạn thớch nghi với chu kỳ sỏng - tối đảo ngược
- Chuột cống trưởng thành được nhốt riờng đực - cỏi, 4 - 5 con/chuồng. - Chuột được nuụi ổn định trong chu kỳ sỏng - tối đảo ngược bằng cỏch bật đốn sỏng vào ban đờm (từ 20h00 đến 8h00) và tắt đốn vào ban ngày (từ 8h00 đến 20h00) trong 3 tuần trước khi tiến hành nghiờn cứu.
2.4.4.2. Giai đoạn chuẩn bị chuột cỏi
Chuột cỏi được gõy động dục nhõn tạo bằng phương phỏp sau: - Chuột cỏi được mổ cắt buồng trứng với quy trỡnh cụ thể như sau: + Gõy mờ chuột cỏi bằng cỏch tiờm màng bụng thiopental natri với liều 40mg/kg và xylazin với liều 40mg/kg.
+ Sau khi chuột đó mờ, đặt chuột nằm sấp, dựng kộo cắt lớp da, lớp mỡ rồi đến lớp cơ lưng; dựng panh kộo lớp mỡ chứa buồng trứng ra ngoài, thắt buồng trứng bằng chỉ tự tiờu rồi cắt bỏ buồng trứng ở trờn chỗ thắt.
+ Khõu lần lượt lớp cơ, lớp mỡ rồi đến lớp da của chuột. Sỏt trựng vết mổ bằng povidon iod.
- Chuột được dự phũng nhiễm khuẩn bằng cỏch tiờm màng bụng khỏng sinh amikacin liều 100mg/kg và giảm đau bằng cỏch tiờm màng bụng piroxicam 3mg/kg.
- Sau khi mổ, chuột được chăm súc hậu phẫu và nghỉ ngơi 14 ngày. - Trước khi tiến hành ghộp đụi với chuột đực, chuột cỏi được gõy động dục bằng cỏch tiờm hormon như sau: 52 giờ trước khi ghộp đụi, tiờm dưới da estradiol benzoat 20 microgam/chuột. Sau đú 4 giờ (trước khi ghộp đụi 48 giờ) tiờm dưới da progesteron 1000 microgam/chuột.
- Khi cho giao phối với chuột đực, những con cỏi khụng cú hành vi chịu đực (như uốn cong lưng khi bị kớch thớch) sẽ bị loại.
2.4.4.3. Giai đoạn huấn luyện (3 đợt)
- Nhốt mỗi chuột đực vào 1 chuồng riờng
- 5 phỳt sau, đưa 1 chuột cỏi gõy động dục nhõn tạo vào.
- Nếu chuột cỏi khụng cú hành vi chịu đực thỡ thay chuột cỏi khỏc. - Đỏnh giỏ cỏc hành vi của chuột đực bao gồm: nhảy cỏi (mounting), thõm nhập õm đạo (intromission), xuất tinh (ejaculation).
- Nếu chuột đực khụng thõm nhập õm đạo trong vũng 30 phỳt thỡ dừng test và coi như chuột đực đú khụng cú khả năng hoạt động tỡnh dục.
- Cỏc hành vi tỡnh dục của chuột được xỏc định như sau:
+ Hành vi nhảy: thường được thực hiện vào thời điểm đầu của loạt giao cấu. Khi chuột đực bắt đầu gặp chuột cỏi, chuột đực sẽ tiếp cận với chuột cỏi từ phớa sau, trốo lờn lưng chuột cỏi và đẩy nhanh, nụng khung chậu về phớa chuột cỏi với tần số 19 - 23 Hz trong vũng 30ms, sau đú con đực rời khỏi lưng con cỏi và liếm cơ quan sinh dục [77],[78],[107]. Như vậy, dấu hiệu để nhận biết hành vi nhảy là diễn ra sớm và hoạt động đẩy khung chậu của chuột đực về phớa õm đạo chuột cỏi diễn ra nhẹ, nụng, ngắn.
+ Hành vi thõm nhập õm đạo: trong quỏ trỡnh tiếp cận, nếu con đực tỡm thấy õm đạo của chuột cỏi, nú sẽ bất ngờ đẩy khung chậu sõu hơn và đỳt dương vật vào õm đạo trong vũng 200 - 300ms. Sau đú, con đực ngừng đẩy khung chậu, rỳt nhanh, mạnh ra khỏi con cỏi và luụn luụn liếm dương vật, con đực sẽ khụng bao giờ tiếp cận trở lại ngay sau khi thõm nhập [77],[78],[107]. Như vậy, dấu hiệu để nhận biết hành vi thõm nhập õm đạo là hoạt động đẩy khung chậu của chuột đực về phớa õm đạo chuột cỏi diễn ra mạnh hơn, sõu hơn và kộo dài hơn hành vi nhảy.
tinh. Xuất tinh được đặc trưng bởi sự đẩy khung chậu sõu và dài hơn (750 - 2000 ms) và rời khỏi con cỏi chậm hơn, sau khi xuất tinh, con đực vẫn cũn ở trờn lưng con cỏi trong vũng 1 - 3 s [77],[78],[107]. Như vậy, hành vi xuất tinh dễ dàng được nhận biết bởi thời gian diễn ra chậm và kộo dài hơn, sau khi xuất tinh, con đực vẫn cũn ở trờn lưng con cỏi 1 - 3s mới chịu rời xuống.
- Chuột đực và chuột cỏi được làm quen (huấn luyện) với test hành vi tỡnh dục trong 3 đợt ghộp, mỗi đợt cỏch nhau 4 ngày.
Mục đớch của cỏc đợt làm quen này nhằm khởi động phản xạ giao cấu, phỏt huy tối đa vai trũ của hệ thần kinh và nội tiết đối với hành vi tỡnh dục của chuột, đồng thời giỳp cỏc nghiờn cứu viờn làm quen với việc quan sỏt hành vi tỡnh dục ở chuột.
Trong quỏ trỡnh ghộp đụi đực - cỏi, quan sỏt và đỏnh giỏ cỏc chỉ số sau [77],[78],[107]:
- MF (số lần nhảy - Mounting Frequency): là số lần con đực nhảy lờn lưng con cỏi trong một loạt giao cấu.
- ML (thời gian nhảy - Mounting Latency): là khoảng thời gian từ khi con đực gặp con cỏi đến lần nhảy đầu tiờn;
- IF (số lần thõm nhập õm đạo- Intromission Frequency): là số lần dương vật con đực thõm nhập vào õm đạo con cỏi trong một loạt giao cấu;
- IL (thời gian đạt đến thõm nhập- Intromission Latency): là khoảng thời
gian từ khi con đực gặp con cỏi đến lần thõm nhập õm đạo đầu tiờn; - EL (thời gian đạt đến xuất tinh- Ejaculation Latency): là khoảng thời
gian từ lần nhảy đầu tiờn (hoặc thõm nhập õm đạo đầu tiờn- nếu khụng cú nhảy) đến lần xuất tinh đầu tiờn;
- PEI (thời gian sau xuất tinh- Post Ejaculation Interval): là khoảng thời gian từ sau khi xuất tinh lần đầu đến lần nhảy hoặc thõm nhập õm đạo tiếp theo (nếu khụng cú nhảy) để bắt đầu một loạt giao cấu mới.
Hỡnh 2.2. Cỏc chỉ số đỏnh giỏ hành vi tỡnh dục ở chuột cống đực
Thử nghiệm kết thỳc khi ghi được PEI, hoặc khi ML, IL > 15 phỳt; EL > 30 phỳt; PEI > 15 phỳt. Những chuột xỏc định được chỉ số PEI được xem là đó hồn thành test hành vi.
Để đảm bảo hoạt động giao cấu của chuột diễn ra một cỏch tự nhiờn và khụng bị ảnh hưởng bởi người quan sỏt, quỏ trỡnh quan sỏt được ghi lại bằng webcam nối với mỏy tớnh, sau đú sẽ được nghiờn cứu viờn đọc và xử lý kết quả, tớnh ra cỏc chỉ số nghiờn cứu.
2.4.4.4. Giai đoạn sàng lọc (4 đợt)
- Chuột được huấn luyện qua 3 đợt, sau đú tiến hành 4 test sàng lọc để phõn loại chuột đực.
- Sau 4 test sàng lọc, cho điểm chuột đực và phõn loại thành những chuột đạt và khụng đạt.
- Những chuột khụng hoàn thành ớt nhất 1 test sàng lọc được xếp vào nhúm chuột khụng đạt.
2.4.4.5. Giai đoạn đỏnh giỏ tỏc dụng của thuốc thử
- Nhúm chuột khụng đạt được chia đều ngẫu nhiờn như sau: + Lụ 1 (n = 9): uống dung mụi pha thuốc với thể tớch 10ml/kg
+ Lụ 2 (n = 7): uống sildenafil liều 10 mg/kg 30 phỳt trước khi ghộp với chuột cỏi
+ Lụ 3 (n = 8): uống OS35 liều 150mg/kg/ngày 15 phỳt trước khi ghộp với chuột cỏi
- Chuột đực được ghộp đụi với chuột cỏi sau khi uống thuốc thử hoặc dung mụi.
Quan sỏt hành vi tỡnh dục, ghi lại cỏc chỉ số nghiờn cứu và so sỏnh cỏc lụ với nhau.