2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thu thập và tách chiết mẫu nghiên cứu
2.3.1.1. Quy trình thu thập mẫu máu tĩnh mạch
Các đối tượng nghiên cứu bao gồm: bệnh nhân (proband hay ca chỉ điểm), anh chị em ruột có triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm của TSTTBS
thiếu 21-OH, bố/mẹ bệnh nhân và nhóm đối chứng được thu thập 2 ml máu
tĩnh mạch, chống đơng bằng EDTA 1,5 mg/mL. Quy trình đảm bảo tuyệt đối vô trùng.
2.3.1.2. Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại vi
DNA được tách chiết theo phương pháp thường quy Phenol/Chloroform - Cho 0,5 ml máu tồn phần chống đơng EDTA vào ống eppendorf 1,5 ml; thêm vào 0,5 ml dung dịch lysis buffer, để trên đá 10 phút, ly tâm 8000
vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, bỏ dịch và thu cặn.
- Cho vào 0,5 ml dung dịch K, ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC, loại bỏ dịch và thu cặn.
- Cho vào 0,5 ml lysis buffer; 12,5µl SDS 10%; 10 µl Protease K; ủ ở 56oC trong 23 giờ. Cho 0,5 ml dung dịch Phenol: Chloroform : Isoamyl; ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC; hỗn hợp được chia làm 3 phần: lớp dung dịch phía trên có chứa DNA, lớp giữa gồm các thành phần của tế bào, lớp dưới cùng là dịch chiết. Hút lấy phần dịch trên cùng chứa DNA và tiến hành lặp lại bước chiết suất này một lần nữa để đảm bảo khơng cịn tạp chất trong mẫu DNA.
- Cho vào dung dịch mẫu DNA 0,5 ml chloroform: Isoamyl, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Hút lấy phần dịch trên cùng và tiến hành lặp lại một lần nữa.
- Tủa DNA bằng 1ml alcol tuyệt đối, thêm 50 μl Na acetat, để lạnh qua đêm ở - 20°C. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC, bỏ dịch trên, thu tủa.
- Rửa tủa bằng cồn 70°. Tủa DNA được hoà tan bằng 50 microlit nước tinh khiết hoặc TE. Dung dịch DNA sẽ được kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang ởbước sóng 260/280 nm.