Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA

(Schouten JP và cộng sự 2002) [87]

+ Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:

 Đoạn 1‟ chứa 2543 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ởđầu tận 5‟.

 Đoạn 2‟ gồm 36 nucleotid ởđầu 3‟, trình tự nucleotid giống nhau cho

các probe. Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe.

 Đoạn 3‟ còn gọi là đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm giữa hai đoạn 1‟ và 2‟, cấu tạo gồm từ19 đến 370 nucleotid. Trình tự nucleotid khơng đặc hiệu với DNA đích nên nó khơng gắn vào DNA đích. Chiều dài đoạn stuffer khác nhau ở các probe, vì vậy các probe khác nhau sẽ có chiều dài khác nhau.

Do đó, sản phẩm khuếch đại của các probe sẽđược phân tách bằng điện di.

Trong mỗi phản ứng có chứa các probe nội chuẩn, khi probe nội chuẩn

lên đỉnh tương ứng là điều kiện đảm bảo độ tin cậy khi nhận định kết quả. Ngoài ra trong kỹ thuật MLPA có sử dụng chứng là DNA của người bình

thường, chạy song song cùng mẫu bệnh nhân để so sánh.

Sau phản ứng PCR, mỗi probe sẽ được khuếch đại thành nhiều bản sao. Các probe khác nhau sẽ có kích thước khác nhau do độ dài đoạn đệm của chúng khác nhau. Do vậy, chúng sẽ được phân tách bằng phương pháp điện di

(thường sử dụng phương pháp điện di mao quản). Số lượng sản phẩm khuếch

đại của mỗi probe sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với probe đó.

Nghiên cứu này sử dụng kit MLPA (MRC- Holland): Kit gồm các probe sử dụng trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2 gọi là P050B2. Hỗn hợp probe này bao gồm 5 probe cho gen CYP21A2 (Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8)

tương đương với các đột biến xóa đoạn đoạn 8 bp, I172N, E6 cluster và Q318X. Hỗn hợp probe này còn bao gồm 3 probe đặc hiệu cho gen

CYP21A1P (E1P, I2P, E10P), 2 probe cho bổ thể C4A, C4B (C4A, C4B).

Ngồi ra, có 22 probe đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng trong hỗn hợp để làm đối chứng và 2 probe cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính. Vịtrí và kích thước của các probe được mô tảnhư bảng 2.2.

Bảng 2.2. Tên, kích thƣớc và vị trí của các sản phẩm PCR trong Kit MLPA P050B2 (MRC- Holland)

STT Tên probe Vị trí của probe trên gen Kích thước (bp)

1 X-fragment X chromosome 100

2 C4B probe 02357-L02586 C4B Exon 19 154

3 CYP21A2 probe 01974-L01507 Exon 3 172

4 C4A probe 04802-L04177 C4A Exon 26 178

5 CYP21A2 probe 04804-L04179 Exon 1 202

6 CYP21A2 probe 01975-L01508 Exon 4 210

7 CYP21A2 probe 01976-L01509 Exon 6 229

8 UTY probe 01071-L00464 Yq11 240

9 CYP21A1P probe 04805-L04180 5’ exon 1 265

10 CYP21A2 probe 05477-L04895 Exon 8 283

11 CYP21A1P probe 04807-L04182 Exon 10 352

12 CYP21A1P probe 04806-L04181 Intron 2 382