- Tiến hành thẩm định độ đúng tại LOQ cho tỷ lệ thu hồi 97% 103%
Thẩm định qui trình phân tích bằng HPLC
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Tính đặc hiệu (tính chọn lọc)
Thực nghiệm:
Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo qui trình phân tích:
Mẫu trắng: Dung mơi pha động, dung mơi hịa tan mẫu, pha lỗng mẫu (nếu cĩ),…
Mẫu giả dược (placebo – mẫu nền) bao gồm các thành phần tương tự như chế phẩm thuốc nhưng khơng chứa dược chất.
Mẫu chuẩn: chứa chất chuẩn cần phân tích pha trong dung mơi pha động. Mẫu chuẩn thường cĩ nồng độ chất cần phân tích ở khoảng nồng độ giữa của đường chuẩn.
Mẫu thử: chứa dược chất cần phân tích. Mẫu thử cĩ nồng độ chất cần phân tích tương đương với nồng độ trong mẫu chuẩn.
Ghi lại các sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích; độ tinh khiết của pic hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử; phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn.
Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Tính đặc hiệu (tính chọn lọc)
Yêu cầu:
Sắc ký đồ các mẫu trắng, mẫu placebo khơng xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.
Sắc ký đồ các mẫu thử cho pic cĩ thời gian lưu tương tự với pic của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu thử nếu xuất hiện thêm các pic khác (pic tạp) khơng phải pic của hoạt chất cần phân tích, thì pic của hoạt chất cần phân tích phải tách hồn tồn khỏi các pic tạp và đáp ứng các yêu cầu chung của phương pháp sắc ký lỏng được qui định trong dược điển.
Pic của hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu thử phải tinh khiết (purity
level xấp xỉ 100%). Hệ số chồng phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích thu
được trong sắc ký đồ và phổ UV của pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn xấp xỉ 1,0.
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Tính đặc hiệu (tính chọn lọc)
Báo cáo:
Cách chuẩn bị và xử lý các mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu giả dược… bao gồm cả lượng cân các thành phần, qui trình xử lý mẫu, hệ số pha lỗng (nếu cĩ).
Sắc ký đồ đại diện cho các loại mẫu. Trong sắc ký đồ phải cĩ các thơng tin như tên mẫu, loại mẫu; và các thơng tin của pic (thời gian lưu, diện tích/chiều cao, mức độ tinh khiết pic, hệ số đuơi, độ phân giải,….)
Kết quả so sánh thời gian lưu, đáp ứng pic (nếu cĩ) của mẫu giả dược, mẫu thử và mẫu chuẩn.
Kết quả so sánh phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn.
Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn
Ví dụ: Xác định tính đặc hiệu của qui trình định lượng desloratadin trong chế phẩm và khi khảo sát độ ổn định của desloratadin trong quá trình xây dựng cơng thức bào chế siro và thành phẩm bằng HPLC với đầu dị PDA
Chuẩn bị các dung dịch mẫu trắng (pha động), mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, mẫu phân giải (mẫu được để trong các điều kiện khắc nghiệt)
Tiến hành sắc ký các mẫu trên
Điều kiện sắc ký: cột pha đảo C8 (250 x 4,6 mm; 5 m). Bước sĩng phát hiện 278 nm. Tốc độ dịng 1,2 ml/phút. Thể tích tiêm 20 l. Pha động: hỗn hợp gồm 25 thể tích acetonitril và 75 thể tích dung dịch đệm phosphat 10 mM (pH 2,5) cĩ chứa 10 mM triethylamin
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Yêu cầu
Thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử và mẫu phân giải tương đương thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng khơng cĩ pic trùng với pic desloratadin
Khi thêm một lượng chất chuẩn desloratadin vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic của desloratadin tăng lên so với trước khi thêm chất chuẩn
Pic desloratadin tách hồn tồn các pic khác trong sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu phân giải (nếu cĩ)
Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic chính trong mẫu thử và mẫu phân giải giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic desloratadin trong mẫu chuẩn
Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic desloratadin khơng cĩ các thành phần khác trong tất cả các mẫu
Đại học Y Dược TPHCM
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Mẫu trắng Viên desloratadin nồng độ 100 µg/ml Chuẩn desloratadin nồng độ 100 µg/ml Viên desloratadin thêm chuẩn Siro desloratadin
nồng độ 100 µg/ml Siro desloratadinthêm chuẩn
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Đại học Y Dược TPHCM
Chuẩn desloratadin Viên desloratadin Siro desloratadin Chuẩn desloratadin Viên desloratadin Siro desloratadin
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Chuẩn desloratadin nồng độ 100 µg/ml Chuẩn chiếu ánh sáng trực tiếp/ 48 giờ Chuẩn đặt ở nhiệt độ trên 60 0C/ 48 giờ
Chuẩn bị thủy phân trong HCl 0,5 N/ 48 giờ
Chuẩn bị thủy phân trong NaOH 0,5 N/ 48 giờ
Chuẩn bị oxy hĩa bởi H2O2 3%/ 24 giờ
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Đại học Y Dược TPHCM Siro desloratadin Trên 60 0C/ 48 giờ Ánh sáng trực tiếp/48 giờ Trên 60 0C/ 48 giờ Ánh sáng trực tiếp/48 giờ Viên desloratadin
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Chuẩn dưới ánh sáng trực tiếp/ 48 giờ
Chuẩn bị thủy phân trong NaOH 0,5 N/ 48 giờ
Chuẩn bị oxy hĩa bởi H2O2 3%/ 24 giờ
Viên desloratadin
trên 60 0C/ 48 giờ Siro desloratadin trên 60 0C/ 48 giờ Siro desloratadin ánh
sáng trực tiếp/ 48 giờ
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Đại học Y Dược TPHCM
Chuẩn dưới ánh sáng trực tiếp/ 48 giờ
Chuẩn bị thủy phân trong NaOH 0,5 N/ 48 giờ
Chuẩn bị oxy hĩa bởi H2O2 3%/ 24 giờ
Viên desloratadin
trên 60 0C/ 48 giờ Siro desloratadin trên 60 0C/ 48 giờ Siro desloratadin ánh
sáng trực tiếp/ 48 giờ
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
(1)(2) (2) (1) (2) (3) (1) (1) (2) (2) (3)
Pha động (mẫu trắng) Mẫu placebo
Mẫu thử Mẫu đối chiếu (1): clorpheniramin maleat, (2): paracetamol, (3): salicylamid
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Tính tuyến tính (khoảng xác định)
Thực nghiệm:
Chuẩn bị dãy các mẫu chuẩn, cĩ nồng độ phải bao phủ khoảng xác định của phương pháp (tối thiểu phải tương ứng với từ 80% đến 120% giá trị hàm lượng so nhãn). Mẫu cĩ nồng độ chất cần phân tích của dãy chuẩn phải lớn hơn giá trị LOQ của phương pháp. Số lượng các mẫu của dẫy chuẩn tối thiểu là 05 mẫu (khơng bao gồm mẫu giả dược). Cĩ thể chuẩn bị các mẫu của dãy chuẩn bằng cách pha lỗng từ một mẫu chuẩn ban đầu với các hệ số pha lỗng khác nhau hoặc từ các mẫu chuẩn với lượng cân chất chuẩn khác nhau.
Tiến hành sắc ký các mẫu, ghi lại các sắc ký đồ và xác định đáp ứng của pic trong các mẫu.
Xác định phương trình hồi qui tuyến, hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn cĩ trong mẫu và đáp ứng pic thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu.
Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Tính tuyến tính (khoảng xác định)
Yêu cầu:
Hệ số tương quan tuyến tính (r) phải ≥ 0,999. Trường hợp r < 0,999 phải cĩ sự giải thích phù hợp.
Báo cáo:
Cách chuẩn bị và xử lý các mẫu chuẩn bao gồm lượng cân, qui trình xử lý mẫu, hệ số pha lỗng (nếu cĩ).
Sắc ký đồ đại diện cho các mẫu.
Kết quả xác định phương trình hồi qui và hệ số tuyến tính:
Stt Lượng cân chuẩn (mg) hoặc hệ số pha lỗng Nồng độ chất cần phân tích trong mẫu (mcg/mL) - X Diện tích pic (mV*s) - Y 1 …. n
Phương trình hồi qui: Y = ax + b Hệ số tương quan: r = ………….
Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic (n=3)
Clorpheniramin maleat Paracetamol Salicylamid
C (µg/ml) S (µV x giây) C (µg/ml) S (µV x giây) C (µg/ml) S (µV x giây)0,63 31447 46,88 2086980 62,50 7546948 0,63 31447 46,88 2086980 62,50 7546948 0,94 48807 70,31 3220332 93,75 11399858 1,25 63445 93,76 4285773 125,00 14943704 1,56 79603 117,20 5355724 156,25 18264351 1,88 97010 140,64 6355724 187,50 21363139 Đại học Y Dược TPHCM
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn
đăng ký thuốc 2013) – Khoảng tuyến tính
Kết quả xử lý thống kê Clorpheniramin Paracetamol Salicylamid Hệ số tương quan 0,9995 0,9998 0,9991 Hệ số B 52482,3 45536,6 110390 Giá trị t của hệ số B 56,4 80,6 40,7 Hệ số Bo -1465,5 -8238,7 904850 Giá trị t của hệ số Bo -1,19 -0,15 2,52 Giá trị F 3175,86 6503,0 1600,5 Giá trị F0,05 10,13 10,13 10,13 Giá trị t0,05 3,18 3,18 3,18
Phương trình hồi quy y = 52482,3x y = 45536,6x y = 110390x
Miền giá trị 0,63 – 1,88 46,88 – 140,64 62,50 – 187,50
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Độ đúng
Thực nghiệm:
Xác định độ đúng của phương pháp bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn cần phân tích vào các mẫu giả dược.
Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạo bằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các mẫu giả dược. Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mức nồng độ 80, 100 và 120% so với mức nồng độ định lượng ghi trong qui trình và nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập.
Phân tích mẫu theo qui trình phân tích. Xác định độ đúng của phương pháp theo cơng thức:
Tỉ lệ thu hồi (%) = (Lượng hoạt chất thu hồi/Lượng HC thêm vào ) x 100%
Yêu cầu:
Độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0% và giá trị RSD ≤ 2,0%. Trường hợp nằm ngồi khoảng này, phải cĩ sự giải thích phù hợp.
Cĩ thể báo cáo độ đúng và giá trị RSD tại mỗi mức nồng độ hoặc tính chung cho tất cả các mức nồng độ.
Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Độ đúng
Báo cáo:
Cách chuẩn bị và xử lý các mẫu bao gồm cả lượng cân, hệ số pha lỗng, nồng độ mẫu…
Sắc ký đồ đại diện cho các mẫu xác định độ đúng của phương pháp.
Kết quả xác định độ đúng của phương pháp:
Mẫu STT Khối lượng giả dược (mg)
Lượng chất chuẩn thêm vào
(mg) Diện tích pic Lượng hoạt chất tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hồi (%) 80% 1 ….. TB RSD 100% …..1 TB RSD 120% …..1 TB RSD
Tỷ lệ thêm chất đối chiếu (%) STT Khối lượng giả dược (mg) Lượng chất chuẩn thêm vào (mg) Diện tích pic (µV x giây) Lượng hoạt chất tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hồi (%) 50 1 75,30 1,50 29404 1,47 98,0 2 75,28 1,60 31177 1,57 98,1 3 75,45 1,71 33444 1,68 98,2 100 1 150,59 3,10 61026 3,06 98,7 2 150,60 3,09 60299 3,03 98,1 3 150,92 3,10 60541 3,07 98,4 150 1 225,89 4,60 91090 4,57 99,4 2 225,90 4,60 91279 4,58 99,6 3 226,00 4,58 90573 4,55 99,3 TB 98,6 SD 0,6 RSD 0,64% Clorpheniramin maleat Đại học Y Dược TPHCM
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn
đăng ký thuốc 2013) – Độ đúng
Tỷ lệ thêm chất đối chiếu (%) STT Khối lượng giả dược (mg) Lượng chất chuẩn thêm vào (mg) Diện tích pic (µV x giây) Lượng hoạt chất tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hồi (%) 50 1 75,30 121,00 2291883 122,49 101,2 2 75,28 121,09 2299562 122,06 100,8 3 75,45 121,05 2260813 120,75 99,8 100 1 150,59 234,45 4368313 233,32 99,5 2 150,60 234,41 4363495 233,38 99,6 3 150,92 234,45 4369444 235,23 100,3 150 1 225,89 351,56 6468528 345,50 98,3 2 225,90 351,68 6470358 345,60 98,3 3 226,00 351,63 6494786 346,90 98,7 TB 98,6 SD 1,1 RSD 1,13% Paracetamol
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn
Tỷ lệ thêm chất đối chiếu (%) STT Khối lượng giả dược (mg) Lượng chất chuẩn thêm vào (mg) Diện tích pic (µV x giây) Lượng hoạt chất tìm lại (mg) Tỷ lệ thu hồi (%) 50 1 75,30 159,93 8146487 161,70 101,1 2 75,28 161,55 8185944 162,51 100,6 3 75,45 162,93 8337332 165,52 101,6 100 1 150,59 312,48 15667826 311,05 99,5 2 150,60 312,42 15639238 310,48 99,4 3 150,92 312,40 15673952 311,17 99,6 150 1 225,89 458,00 22630971 449,29 98,1 2 225,90 458,90 22687354 450,04 98,3 3 226,00 458,80 22727882 451,21 98,3 TB 98,7 SD 1,4 RSD 1,41% Salicylamid Đại học Y Dược TPHCM
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn
đăng ký thuốc 2013) – Độ đúng
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Độ chính xác – Độ lặp lại
Tính thích hợp của hệ thống
Thực nghiệm:
Chuẩn bị mẫu thử hoặc chuẩn theo qui trình. Nồng độ hoạt chất trong mẫu tương ứng với nồng độ giữa của đường chuẩn. Lượng mẫu thử đủ cho ít nhất 5 lần tiêm mẫu.
Tiến hành sắc ký, ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic trung bình và các thơng số khác của pic (độ phân giải, hệ số đuơi,..).
Yêu cầu:
Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải ≤ 2,0%, nếu khơng cĩ qui định khác. Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải cĩ sự giải thích phù hợp.
Các thơng số khác của pic phải đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp sắc ký qui định trong Dược điển và qui định cụ thể trong đề cương thẩm định đối với phương pháp.
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Độ chính xác – Độ lặp lại
Tính thích hợp của hệ thống
Báo cáo:
Cách chuẩn bị và xử lý mẫu bao gồm lượng cân, qui trình xử lý mẫu, hệ số pha lỗng…
Sắc ký đồ đại diện cho các mẫu xác định tính thích hợp của hệ thống.
Kết quả xác định tính thích hợp của hệ thống:
Đại học Y Dược TPHCM Nguyễn Đức Tuấn
Stt Thời gian lưu (phút)
Diện tích pic (mV*s)
Chiều cao pic (mV) Thơng số khác (nếu cĩ) 1 …. n ≥ 5 Trung bình SD RSD (%)
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Độ chính xác – Độ lặp lại
Độ lặp lại
Thực nghiệm:
Tiến hành phân tích tối thiểu ở 3 nồng độ, mỗi nồng độ 3 lần trong khoảng nồng độ đã xác định của qui trình.
Hoặc tiến hành phân tích tối thiểu 06 mẫu thử ở nồng độ 100%.
Xác định hàm lượng hoạt chất cĩ trong các mẫu.
Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất cĩ trong các mẫu.
Yêu cầu:
Giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất cĩ trong các mẫu ≤ 2,0%. Các trường hợp giá trị RSD > 2%, cần phải cĩ sự giải thích phù hợp.
Thẩm Định Qui Trình Phân Tích bằng HPLC – PDA (theo Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc 2013)
Độ chính xác – Độ lặp lại
Độ lặp lại
Báo cáo:
Cách chuẩn bị và xử lý các mẫu bao gồm lượng cân, qui trình xử lý mẫu, hệ số pha lỗng
Sắc ký đồ đại diện cho các mẫu thẩm định độ lặp lại.
Kết quả xác định độ lặp lại: