CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Bacteriocin
1.3.6. Một số loài vi khuẩn khác sinh bacteriocin
Bacteriocin được sinh tổng hợp nên bởi rất nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Bảng
1.4 mô tả các loại bacteriocin của một số vi khuẩn Gram dương.
Bảng 1.4. Bacteriocin của một số chủng vi khuẩn
Chủng Loại bacteriocin
Bacillus cereus Phospholipase A
Clostridium botulinum Boticin
Lactobacillus Lactocin
Listeria monocytogenes Monicin
Micrococcus Micrococcin Mycobacterium Mitomycin Staphylococcus Staphylococcin Streptococcus Streptococcin [10] 1.3.7. Ứng dụng của bacteriocin
Trong những năm trở lại đây, bacteriocin được ứng dụng rộng rãi trong công
nghiệp thực phẩm như một công cụ để kiểm sốt vi khuẩn có hại trong thức ăn. Tới ngày nay, những bacteriocin thương mại duy nhất là nhóm nisin được sinh bởi Lactoccocus lactis, và PA-1 pediocin sinh bởi Pediococcus acidilactici.
Nhiều nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học trên thế giới đều nhận định rằng các LAB có lợi cho sức khoẻ của người cũng như các loài động vật máu nóng.
Bifidobacteria được tìm thấy như là một phần trong hệ vi sinh vật tự nhiên có mặt trong
hệ tiêu hoá. Nghiên cứu cơ chế hoạt động của chúng chỉ ra rằng chúng có lợi cho sức khỏe, không những chúng sản sinh ra các sản phẩm có lợi như: acid lactic, vitamin mà cịn sinh ra các kháng sinh vi sinh vật (bacteriocin) làm ức chế và kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột có hại. Điểm đặc biệt nữa của chúng là có khả năng sống
được trong điều kiện môi trường acid cao, khả năng chịu mặn lớn.
Bacteriocin được ứng dụng nhiều trong thực phẩm. Bacteriocin được ứng dụng trong giai đoạn đầu của việc ủ bột làm bánh mì, trong lên men xúc xích (kháng Listeria)
và trong sản xuất phomai (kháng Listeria và Clostridium).
Ứng dụng bảo quản thịt:
Listeria monocytogenes là vi khuẩn hình que yếm khí Gram dương, không tạo
bào tử và phân bố rộng trong mơi trường sống. Nó có thể phát triển ở khoảng pH 4.1 đến 9.6 và nhiệt độ từ 0 đến 450C. Hơn thế nữa, nó có thể chịu được độ ẩm cao và có thể
phát triển với hoạt độ của nước aw khoảng 0.9. Do đó chính phủ Mỹ đã đưa ra chính sách
liên quan đến L. monocytogenes ở mức độ là 0 đối với thực phẩm ăn liền. Có rất nhiều
nghiên cứu được đưa ra để kiểm soát lượng L. monocytogenes trong thịt khi nó rất phổ
biến trong lị giết mổ và khu vực đóng gói thịt.
Pawar và cộng sự (2000) đã thử nghiệm bảo quản thịt bò chống lại L. monocytogenes của nisin với hoạt tính 400 và 800 IU/g kết hợp với NaCl 2%. Với mẫu
bảo quản, thịt được xay và nuôi cấy với L. monocytogenes với mật độ 103 cfu/g và bảo quản ở 40C. Lượng L. monocytogenes trong mẫu đối chứng tăng từ 3.0 log10 đến 6.4 log
cfu/f sau 16 ngày bảo quản. Nisin với hoạt tính 400 IU/g làm tăng pha lag của L. monocytogenes, ở hoạt tính 800 IU/g lượng L. monocytogenes là 2.4 log10 thấp hơn so với mẫu đối chứng sau 16 ngày bảo quản. Khi nhiệt độ bảo quản tăng lên 370C thì khả
năng ức chế của nisin giảm đi. Thay vào đó lương NaCl 2% kết hợp với nisin đã làm tăng hiệu quả của nisin ở cả hai nhiệt độ bảo quản này [10].
Ứng dụng bảo quản sản phẩm hải sản:
Nilsson và cộng sự (1997) đã khảo sát khả năng ức chế của nisin kết hợp với
carbon dioxide và nhiệt độ thấp lên sự sống sót của L. monocytogenes trong cá hồi xơng khói. Sử dụng nisin có nồng độ 500 và 1000IU/g vào cá hồi được nuôi cấy với L. monocytogenes và bảo quản ở 50C nhưng khơng phịng ngừa được sự phát triển của L.
monocytogenes trong bao gói chân khơng. Lượng L. monocytogenes tăng đến 108 cfu/g
đối với cá hồi bao gói chân khơng trong tám ngày, trong khi đó đối với cá hồi xơng khói
lạnh đóng gói với CO2 thì lượng L. monocytogenes trong thời kì pha log của ngày thứ
tám đạt được 106 cfu/g trong 27 ngày. Việc thêm nisin với nồng độ lần lượt là 500 và 1000 IU/g vào cá hồi xơng khói lạnh đóng gói CO2 làm giảm 1 đến 2 log10 lượng L. monocytogenes ở lần lượt ngày thứ 8 và 20 của pha lag. Như vậy, lượng L. monocytogenes vẫn còn dưới 103 cfu/g trong suốt 27 ngày bảo quản ở hai nồng độ nisin [10].
Ngồi ra cịn có những ứng dụng của bacteriocin như:
+ Ứng dụng của bacteriocin trong bảo quản những sản phẩm từ sữa .
+ Bảo quản sinh học của sản phẩm trái cây. + Quá trình lên men rau quả.
+ Thức uống chứa cồn.
+ Trong sản phẩm dược liệu, thú y và chăm sóc sức khỏe [16].
1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất bacteriocin
Với khả năng ức chế những vi sinh vật gây bệnh và được ứng dụng trong bảo
quản thực phẩm nói riêng và đến sức khỏe con người nói chung nên bacteriocin đã được nhiều nhà khoa học quan tâm.
1.4.1. Các nghiên cứu trong nước
Hiện nay ở nước ta việc nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng
hợp nên đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên các nghiên cứu về ứng dụng của bacteriocin cịn ít và chưa thu được những kết quả khả quan.
Năm 2007, PGS.TS. Trương Nam Hải đã thực hiện đề tài “Nâng cao chất lượng,
hiệu quả bảo quản nông sản bằng chế phẩm Nisin và Enterocin” với kết quả đạt được
là:
Từ 148 mẫu dưa muối, cà muối, sữa chua, sữa tươi, sữa mẹ, nem chua, pho mát
đã phân lập được 148 chủng vi khuẩn lactic. Từ 148 chủng vi khuẩn lactic được phân lập đã tuyển chọn được 12 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh nisin cao ức chế mạnh đến sự phát triển của vi khuẩn chỉ thị B. cereus. Sau khi đánh giá khả năng kháng B.
coagulans, C. perfrigens, S. aureus, Salmonella, E. coli, L. monocytogenes đã tuyển
chọn được hai chủng L.lactis kí hiệu là C46 và C40 có hoạt tính ức chế mạnh các vi
khuẩn gây bệnh trên. Để nâng cao khả năng kháng khuẩn, môi trường ni cấy thích hợp cho chủng đó được khảo sát đó là mơi trường M17 có bổ sung 0.5% lactose, 1% cao nấm men, pH6 là tốt nhất cho sự sinh tổng hợp nisin của chủng L. lactis. Hoạt tính nisin
đạt cực đại sau 24 giờ nuôi cấy và được duy trì lâu hơn so với các thời gian khác. Trong
khi lên men, oxy hòa tan khoảng 60% bão hịa là thích hợp nhất cho sự sinh tổng hợp nisin của chủng L. lactis C46. Bằng phương pháp sinh học phân tử, đã xác định được
chủng C46 chính là Lactococcus lactis C46 và đã chứng minh được hoạt tính kháng
khuẩn có được từ chủng phân lập là nisin.
Năm 2008, để nâng cao sản lượng nisin đã áp dụng công nghệ nuôi cấy hỗn hợp
với chủng K. marxianus và lên men gián đoạn hai pha. Kết quả sản lượng nisin trong
dịch nuôi cấy hỗn hợp chủng L. lactis C40 và K. marxianus tăng gấp khoảng 1.5 lần so
với khi nuôi cấy chủng L. lactis C40 tự do. Hoạt độ nisin đạt cực đại là 5.6x104 AU/ml sau 24 giờ nuôi cấy. Hơn nữa, khi lên men gián đoạn hai pha, sau 24 giờ nuôi cấy hoạt
độ nisin trong môi trường đạt được là 6.8x104 AU/ml, tăng 19% so với lên men một pha.
Đồng thời, đã cố định tế bào lên alginate trong quá trình lên men gián đoạn hai pha nhưng sản lượng nisin tăng không đáng kể, đạt 6.9x104 AU/ml sau 24 giờ nuôi cấy. Khi bổ sung thêm lactose vào môi trường nuôi cấy theo giờ, hoạt độ nisin trong môi trường
tăng lên đáng kể, tối đa đạt 38x104 AU/ml sau 24 giờ nuôi cấy.
Tác giả cũng đã nghiên cứu thu hồi nisin bằng muối NaCl, ethanol và methanol. Kết quả cho thấy ở nồng độ methanol 60%, ethanol 50% và NaCl 1% đều cho hiệu suất thu hồi nisin khoảng 80-85%. Đồng thời, khi bổ sung với chất phụ gia như sữa gầy, hoạt
tính nisin sau năm tháng bảo quản vẫn giữ được 95%.
Năm 2008, tác giả đã tập trung vào biểu hiện enterocin P của E. faecium trong
nhiều loại tế bào chủ khác nhau đó là E. coli, Bacillus và nấm men. Mặc dù sản lượng EntP không cao nhưng peptide tái tổ hợp đã có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus. Từ các chủng tái tổ hợp nhận được, đã chọn ra một số dòng cho sản lượng EntP tốt để
được cắt bằng DTT hoặc pH để giải phóng EntP có hoạt tính sinh học. Điểm thuận lợi là
hầu hết protein dạng lai đều ở trạng thái khơng tan trong nước, do đó đã ly tâm để loại bỏ các protein tan trong nước để thu protein lai. Sau khi cắt bỏ đoạn protein lai, protein lai lại trở thành dạng tan trong nước nên sau khi ly tâm loại bỏ protein pha trên, thu được
lượng EntP khá sạch. EntP này có khả năng kháng lại Staphylococcus aureus.
Chủng nấm men tái tổ hợp mang gen entP cũng đã được tối ưu lên men. Khi sử dụng lên men batch thông thường, OD600 của tế bào chỉ đạt được 0.3. Ở điều kiện này, lượng EntP sinh ra thấp nên khi điện di trực tiếp dịch lên men trên gel polyacrylamide,
hầu như băng EntP không phát hiện được. Tuy nhiên hoạt tính của EntP trong môi
trường nuôi cấy cũng đạt được là 100AU/ml môi trường. Tác giả đã tối ưu qui trình lên men để tăng sinh khối. Kết quả, khi lên men được bổ sung gián đoạn nguồn dinh dưỡng,
OD600 của môi trường nuôi cấy đã đạt được trên 0.9 (gấp ba lần so với lên men thông thường). Đồng thời hàm lượng EntP tăng lên đáng kể, thể hiện là một băng protein có kích thước khoảng 4 kDa trên điện di đồ. Hoạt độ của EntP trong môi trường nuôi cấy
cũng đã được xác định [2].
Năm 2008, các tác giả Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An đã nghiên cứu
thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactis cố định trên chất mang Cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt sơ chế tối thiểu. Kết quả thu được: Hiệu quả sử dụng chế phẩm tế bào vi khuẩn cố định trên BC để lên
men thu nhận bacteriocin khá cao: có thể tái sử dụng 9-10 lần mà vẫn đảm bảo về mặt thời gian lên men, số lượng và chất lượng bacteriocin so với đối chứng. Bước đầu sử
dụng màng mỏng cellulose vi khuẩn (BC) hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu: có thể bảo quản thịt tươi đến ba ngày bằng màng BC hấp phụ dịch bacteriocin 200 AU/ml vẫn đảm bảo chất lượng thịt, theo TCVN 7046:2002. Kết quả thu
được cũng góp phần thăm dò hai ứng dụng mới của cellulose vi khuẩn (BC): sử dụng
BC làm chất mang trong kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật và sử dụng màng mỏng BC làm màng bao thực phẩm [4].
Năm 2009, Nguyễn Văn Duy đã thực hiện đề tài “Tuyển chọn các chủng vi khuẩn
lactic sinh bacteriocin nhằm bảo quản thực phẩm”. Tác giả đã tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin mạnh từ nước dưa chua ở Việt Nam để tiến tới sử dụng chúng trong bảo quản cá Giò nguyên liệu tươi. Vi khuẩn lactic được phân lập và tuyển chọn trên môi trường MRS và cho thử hoạt tính đối kháng với vi khuẩn đích
Salmonella typhimurium. Kết quả cho thấy đề tài đã phân lập được 45 chủng vi khuẩn
lactic trong đó có 12 chủng kháng mạnh nhất với Salmonella. Các chủng đều là vi khuẩn Gram dương, phản ứng âm tính với oxidase và catalase. Kết quả này là cơ sở khoa học
quan trọng cho việc nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thực phẩm.
1.4.2. Các nghiên cứu nước ngoài
Hiên nay việc nghiên cứu, ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp
nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm. Và cũng đã có
những cơng trình nghiên cứu và ứng dụng thành cơng, góp phần vào việc nâng cao chất
lượng cuộc sống của nhân loại. Bacteriocin là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế
một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà việc ứng dụng của vi khuẩn lactic đa
dạng và phong phú hơn.
Năm 1999, các tác giả Raf Callewaert và Luc De Vuyst đã nghiên cứu việc sinh
tổng hợp bacteriocin của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men. Việc sinh tổng hợp thu nhận bacteriocin bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen.
Năm 1999, nhóm tác giả Farida Khalid, Roquya Siddiqi và Naheed Mojgani đã
nghiên cứu tìm ra một loại bacteriocin mới có tên lactocin LC-09. Lactocin LC-09 được phân lập từ chủng vi khuẩn Lactobacillus có trong một mẫu bệnh. Loại này ức chế được một số loại Lactobacillus và vi khuẩn Gram dương khác như Listeria ivanovii, Streptococcus agalactii và S. peyogenes. Đặc tính của Lactocin LC-09 là chịu nhiệt (4
giờ ở 1000C) và thích hợp với mơi trường có pH acid. Loại bacteriocin này bị khử hoạt tính bằng cách sử dụng enzyme protease. Có thể dùng acridine orange, ethidium
bromide để gây đột biến trong việc sản sinh ra loại bacteriocin này.
Năm 2002, Soore và cộng sự đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng khuẩn đặc
biệt của vi khuẩn lactic gọi là bacteriocin. Bacteriocin được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất bảo quản khác.
Bacteriocin có bản chất là protein nên rất an tồn đối với sức khoẻ con người.
Năm 2004, nhóm tác giả Todorov SD, Van Reenen CA và Dicks KM đã nghiên
cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum ST13BR ,
một chủng được phân lập từ bia Barley. Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn
Lactobacillus plantarum được phân lập từ bia barley (kích thước phân tử 10kDa) ức chế
sự phát triển của vi khuẩn Lactobacillus casei, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus
faecalis, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli. Nghiên cứu đã đưa ra được các loại
mơi trường có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất.
Năm 2006, 50 chủng vi khuẩn lactic được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền
thống suan-tsai (mù tạc lên men) của Đài Loan. Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh tổng hợp
bacteriocin.
Năm 2006, Stefan Marcinowski cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi khuẩn
có lợi Lactobacillus do cơng ty hố chất BASF của Đức phát triển. Đây là sản phẩm
giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng. Chủng Lactobacillus mới có tên là L.
anti-caries có khả năng sinh bacteriocin làm cho vi khuẩn gây sâu răng kết thành khối
khơng thẻ dính trên bề mặt răng và bị loại bỏ dễ dàng khi súc miệng [28].
Năm 2006, 35 trong số 48 chủng phân lập từ kefir ức chế sự phát triển của
Lb.casei LHS, từ kết quả trên chủng phân lập được có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất là
ST8KF. Chủng này tạo ra bacteriocin có tên là ST8KF có trọng lượng phân tử 3.5 kDa có khả năng kháng lại Lb.casei, Lb.curvatus và Listeria innocua. BacST8KF nhạy cảm
với enzyme thủy phân, nhưng ổn định giữa pH 2 và 10, chịu nhiệt (20 phút ở 1210C). BacST8KF không hấp thụ bề mặt của tế bào sản xuất. Hoạt tính tối đa thu được (25600AU/ml) trong môi trường MRS với glucose, trong môi trường MRS với glucose được thay thế bởi sucrose, và trong môi trường MRS với glucose bổ sung với KH2PO4 sau 24 h ở 300C [19].
Năm 2007 nhóm tác giả S.D. Todorov và Leon M.T. Dicks KM đã nghiên cứu
khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Lactobacillus pentosus ST712BZ được
phân lập từ boza (nước uống lên men). Bacteriocin ST712BZ (kích thước 14kDa) ức chế sự phát triển của Lactobacillus casei, E.coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococus faecalis, Klebsiella pneumoniae and Lactobacillus curvatus. Sự phát triển của chủng
ST712BZ trên môi trường BHI, M17, sữa đậu nành và mật đường tương tự như trên môi trường MRS với việc sinh tổng hợp bacteriocin cực đại (12800AU/ml) được ghi nhận
trên môi trường MRS sau 24h. Nghiên cứu đã đưa ra được các loại mơi trường, nhiệt độ và pH có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và thành phần hỗn hợp các loại môi trường mà việc sinh tổng hợp bacteriocin là lớn nhất.
Các nhà nghiên cứu CSIRO để tìm ra một vài bacteriocin và sử dụng chúng để tiêu diệt những chủng vi khuẩn gây bệnh giống trong gà và lợn. Bộ gen cho phân tử bacteriocin sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh hoặc vi rút mà có thể sinh