Vi hiếu khí Kỵ khí
L2, L3, L5 L1, L4, L7
Quan sát đặc điểm sinh lý của sáu chủng phân lập từ hạt kefir có ba chủng vi hiếu
khí (L2, L3, L5) với sinh khối mọc cả trên bề mặt thạch và dọc theo đường cấy từ trên xuống. Các chủng kỵ khí là L1, L4, L7 với sinh khối không mọc trên bề mặt thạch mà chỉ mọc ở dọc theo đường cấy và dưới đáy thạch được thể hiện ở bảng 3.2.
3.1.4. Đặc điểm sinh hóa
Thực hiện các phản ứng sinh hóa như trắc nghiệm catalase, khả năng sử dụng các loại đường.
Trắc nghiệm catalase
Kết quả thử nghiệm catalase cho thấy cả sáu chủng đều có phản ứng catalase âm tính khi nhỏ H2O2 vào sinh khối tế bào thì khơng có hiện tượng sủi bọt khí xảy ra. Tuy nhiên, với mẫu đối chứng là chủng vi khuẩn hiếu khí E. coli, khi nhỏ giọt H2O2 vào thì có hiện tượng sủi bọt khí do E. coli có khả năng sinh enzyme catalase phân hủy H2O2
thành H2O và O2. Vậy, cả sáu chủng đều là vi khuẩn kỵ khí.
Bảng 3.3. Kết quả thử khả năng sinh catalase của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
được từ hạt kefir.
Chủng
Phản ứng L1 L2 L3 L4 L5 L7
Catalase - - - - - -
Chú thích: + : Dương tính - : Âm tính
Khả năng lên men các loại đường
Tiến hành thử nghiệm khả năng lên men với các loại đường khác nhau đối với sáu chủng nhằm xác định khả năng lên men nguồn cacbon trong môi trường MRS dịch thể của chúng, đồng thời xác định có sự sinh hơi hay khơng trong q trình lên men. Kết quả nhận thấy cả sáu chủng đều có khả năng lên men tất cả bốn loại đường: sucrose, lactose, glucose và sorbitol sinh acid làm giảm pH môi trường biến đổi màu chất chỉ thị phenol red từ đỏ sang vàng (riêng đối với lên men đường glucose thì làm biến đồi màu ít hơn so với mẫu ĐC2). Đồng thời cả sáu chủng đều không sinh hơi trong quá trình lên men tất cả bốn nguồn đường trên. Vậy, cả sáu chủng đều lên men bốn loại đường lactose, sucrose, sorbitol và glucose (hình 3.4, 3.5, 3.6, 3.7).
Bảng 3.4. Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir.
Chủng L1 L2 L3 L4 L5 L7
Khả năng sinh hơi - - - - - -
Khả năng lên men đường lactose
Hình 3.5. Khả năng lên men đường lactose của sáu chủng vi khuẩn.
- ĐC1: Môi trường không nuôi cấy vi sinh vật - ĐC2: Mơi trường có bổ sung phenol red.
Khả năng lên men đường sucrose
- ĐC1: Môi trường không nuôi cấy vi sinh vật - ĐC2: Mơi trường có bổ sung phenol red.
Hình 3.6. Khả năng lên men đường sucrose của sáu chủng vi khuẩn.
Khả năng lên men đường sorbitol
- ĐC1: Môi trường không nuôi cấy vi sinh vật - ĐC2: Môi trường có bổ sung phenol red.
Khả năng lên men đường glucose
- ĐC1: Môi trường không nuôi cấy vi sinh vật - ĐC2: Mơi trường có bổ sung phenol red.
Hình 3.8. Khả năng lên men đường glucose của sáu chủng vi khuẩn.
Tóm lại, qua các kết quả quan sát đại thể, vi thể, kiểm tra sinh lý, sinh hóa của bảy chủng phân lập, chúng tôi xác định được sáu chủng Gram dương đều là vi khuẩn LAB (L1, L2, L3, L4, L5, L7). Với mục đích kiểm tra khả năng sinh hoạt tính
bacteriocin của sáu chủng này, chúng tơi tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn thông qua chủng chỉ thị là Bacillus subtilis.
3.1.5. Kiểm tra hoạt tính bacteriocin
Thử nghiệm khả năng sinh bacteriocin của tất cả sáu chủng phân lập với chủng chỉ thị là Bacillus subtilis cho thấy tất cả sáu chủng đều cho hoạt tính kháng khuẩn (L1, L2, L3, L4, L5, L7) kháng chủng chỉ thị tạo vùng trong suốt, khơng có sự tăng trưởng
Chủng Hình Đường kính kháng khuẩn (mm) L1 15 L2 17 L3 15 L4 14
L5 16
L7 16
ĐC: môi trường MRS không nuôi cấy vi sinh vật
Hình 3.9. Khả năng tạo vùng kháng khuẩn của các chủng phân lập
Vậy chủng L2 sinh hoạt tính bacteriocin cao chất trong tất cả các chủng còn lại.
Xác định hoạt tính bacteriocin thơ của chủng L2
Xác định hoạt tính bacteriocin của chủng L2 trong những điều kiện sau: Nuôi cấy trong môi trường MRS, 300C, 48 giờ. Dịch sau lên men được điều chỉnh về pH 5.5 nhằm loại bỏ tác động kháng khuẩn của các acid được sinh ra trong q trình ni cấy. Kết quả hoạt tính của chủng L2 là 457 AU/ml.
AU/ml = DFi x (1/ Vbacteriocin)
= 24 x(1/ 0.035) = 457 AU/ml Với 4: độ pha lỗng cao nhất có vịng ức chế.
Sau khi đã kiểm tra hoạt tính bacteriocin của sáu chủng LAB, để biết kết quả
3.1.6. Định danh vi khuẩn lactic bằng bộ kit API 50 CHL
Đối với LAB sau khi thực hiện khảo sát các tính chất sinh lý và thực hiện sơ bộ
các phản ứng sinh hóa ta thực hiện bộ kit API 50 CHL để định danh chủng LAB. Với yêu cầu của đề tài đặt ra, chúng tôi dùng bộ kit này để định danh chủng vi khuẩn lactic (L2) có hoạt tính bacteriocin cao nhất trong tất cả năm chủng còn lại.
Kết quả định danh sử dụng bộ kit API 50 CHL đối với chủng L2 là Lactobacillus
acidophilus với độ tương đồng là 98.5%.
Hình 3.10. Kết quả bộ kit định danh chủng L2 phân lập từ hạt kefir
3.2. Ứng dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng sơ chế tối thiểu 3.2.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin 3.2.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin
Với mục đích sử dụng bacteriocin từ LAB phân lập từ hạt kefir để bảo quản cá, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin này đối với hai chủng chỉ thị đặc trưng là Bacillus subtilis (Gram dương) và E.coli (Gram âm). Kết quả khả năng kháng khuẩn được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khả năng kháng khuẩn của chủng Lactobacillus acidophilus (L2)
Chủng vi khuẩn chỉ thị Đường kính vịng kháng khuẩn (mm)
Bacillus subtilis 17
Từ bảng 3.5 cho thấy dịch bacteriocin từ chủng Lactobacillus acidophilus (L2) có hoạt tính ức chế cả vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis) và vi khuẩn Gram âm (E.
coli).
Hình 3.11. Khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng Lactobacillus acidophilus
(L2) đối với E. coli
3.2.2. Sử dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng
Việc đảm bảo an toàn là một việc hết sức quan trọng trong bảo quản, chế biến và chất lượng sản phẩm. Trong q trình bảo quản thực phẩm có nhiều phương pháp để bảo quản khác nhau: vật lý, hóa học, sinh học,…Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm
riêng, trong khi đó phương pháp vật lý và hóa học đều làm ảnh hưởng đến chất lượng
sản phẩm cũng như những dư lượng hóa chất cịn tồn đọng gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe của con người. Do đó việc bảo quản thực phẩm bằng tác nhân sinh học đã và đang thu hút được nhiều sự chú ý của các nhà khoa học, đó là sử dụng bacteriocin từ
LAB làm tác nhân sinh học để bảo quản thực phẩm.
Cá sau khi giết mổ thường giảm cả về chất lượng cảm quan lẫn chất lượng vi sinh.
Đồng thời, cá ở nhiệt độ thường là môi trường lý tưởng cho vi sinh vật phân hủy phát
triển hơn ở gia súc và gia cầm [3]. Trong khảo sát này, chúng tôi sử dụng dịch
bacteriocin thô để bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế.
Dịch bacteriocin thô được thu hồi từ việc lên men chủng Lactobacillus acidophilus (L2) bằng phương pháp ly tâm thu dịch nổi và chuyển pH về 5.5 bằng
NaOH 5N.
Cá sau khi giết mổ được chia làm năm mẫu thí nghiệm với các phương pháp bảo quản khác nhau (bảng 2.1). Kết quả đánh giá chất lượng các mẫu thịt sau thời gian bảo quản được trình bày trong bảng 3.6.