Dương tính giả

a) Trước xét nghiệm: Do ống môi trường vận chuyển bị nhiễm, khả năng này ít xảy ra nhưng vẫn có thể gặp do ống chứa mơi trường vận chuyển khi bảo quản ở phòng xét nghiệm chưa đúng cách (chẳng hạn để chung trong tủ với bệnh phẩm) hoặc chuyển xuống khoa lâm sàng nhưng điều dưỡng viên bỏ quên dẫn đến để lâu khiến chất lượng ống khơng tốt. Để khắc phục thì cần dùng ống cịn hạn sử dụng và khơng phát ống mơi trường quá nhiều cho lâm sàng. Tốt nhất khi giao nhận mơi trường cần kí sổ người giao nhận, ngày giờ và số lượng ống phát ra để sau này tiện tra cứu.

b) Trong xét nghiệm:

- Nhiễm chéo từ mẫu dương cao tách cùng mẻ chạy: Khi tách chiết 24 mẫu cùng nhau, nếu trong mẻ tách có những mẫu tải lượng virus cao mà thao tác pipette lại khơng tốt, tạo giọt bắn thì rất dễ nhiễm sang các mẫu lân cận. Có thể phát hiện được khả năng này khi luôn tách cùng mẫu Mock là mẫu chỉ có nước cất thay vì bệnh phẩm. Nếu mẫu mock hay còn gọi là chứng âm tách chiết dương tính thì nên làm lại cẩn thận hoặc thay KTV khác tách chiết. Nếu kết quả vẫn dương thì cần thay bộ hóa chất tách chiết mới bởi lúc này khả năng cao là hóa chất dung dịch tách chiết đã bị nhiễm. Ngồi hóa chất thì các thiết bị phụ trợ dùng trong tách chiết như máy vortex, máy ly tâm và đặc biệt pipette cũng cần vệ sinh thường xuyên bằng cồn hay dung dịch khử DNA, RNA nhằm loại bỏ nguy cơ nhiễm. Mơi trường phịng tách chiết cũng phải bật đèn cực tím thường xun vừa để đảm bảo an tồn sinh học vừa giảm thiểu nguy cơ nhiễm PCR.

- Nhiễm chứng âm hóa chất (NTC control): Chứng âm hóa chất bị nhiễm thường do hóa chất mở ra mở vào nhiều lần hoặc sử dụng chung pipette với phòng tách chiết hay tra mẫu. Khi hiện tượng này xảy ra cần kiểm tra lại cẩn thận và bỏ bộ hóa chất bị nhiễm ngay. Tuyệt đối không di chuyển pipette từ phịng sạch (hóa chất) sang phịng tách chiết hay tra mẫu và ngược lại. Ngồi ra cần tn thủ quy trình xét nghiệm là pha mix trước, sau đó mới làm tách chiết và tra mẫu PCR. Nếu có q nhiều mẻ chạy thì nên

phân cơng người chun pha mix, người chuyên tách chiết để giảm thiểu nguy cơ ra vào phịng xét nghiệm khơng hợp lý dẫn đến sai sót.

- Nhiễm chéo từ chứng dương khi tra mẫu: sau khi tách chiết xong, tra mẫu vào đĩa PCR cần thao tác pipette chính xác và cẩn thận. Tốt nhất tra mẫu trước, sau đó đậy nắp lại rồi mới thao tác đến chứng dương để giảm thiểu nguy cơ này. Đặc điểm của kiểu nhiễm này thường rơi vào các giếng gần vị trí chứng dương nên kĩ thuật viên cần lưu ý chạy lại nếu nghi ngờ.

- Nhiễm amplicon trong quá trình chạy PCR: ampli- con là các bản sao DNA được tổng hợp trong quá trình PCR. Đối với PCR Real time, các bản sao này được giữ nguyên trong ống phản ứng, tuy nhiên nếu không may ống bị hở nắp (do nhiệt độ cao) hoặc nút khơng chặt dẫn đến bay hơi thì amplicon sẽ thốt ra ngồi. Chỉ cần 1 lượng nhỏ amplicon thoát ra sẽ làm nhiễm máy real - time và mơi trường phịng máy. Nếu máy realtime bị nhiễm ở block nhiệt thì mẻ chạy xét nghiệm tiếp theo sẽ bị ảnh hưởng nặng nề bởi kiểu nhiễm này thường có đồ thị lên rất sớm và đều nhau ở gần như tất cả các giếng nên không thể nhận định được kết quả. Chưa kể việc khắc phục hậu quả do nhiễm amplicon là tương đối gian nan và cần thời gian để lượng amplicon trong môi trường PXN giảm dần. Các giải pháp nhằm giảm thiểu nguy cơ nhiễm amplicon gồm:

+ Tập huấn cẩn thận nhân viên việc đóng chặt nắp ống PCR sau khi tra mẫu xong bởi chỉ cần một người bất cẩn thơi là cả phịng xét nghiệm vất vả.

+ Hạn chế chạy máy liên tục, cần cho máy thời gian nghỉ ngơi, tốt nhất 1 đến 2 tiếng giữa các mẻ chạy.

+ Vệ sinh phòng máy bằng cồn và dung dịch DNAaway và đèn cưc tím thường xun.

Dương tính giả do hóa chất để lâu: Thường là do probe giảm chất lượng dẫn đến tín hiệu khó phân biệt giữa nhiễu và đồ thị chuẩn. Trường hợp này thường gặp khi ống probe đã tan đông nhiều lần hoặc master mix đã dùng gần hết nên nồng độ probe/mồi bị ảnh hưởng. Khác với các trường hợp dương tính giả nêu trên, trường hợp này đồ thị thường xấu và không rõ curve, đơi khi tín hiệu huỳnh quang chỉ ngóc lên chút rồi chạy ngoằn ngoèo. Lúc này thì nên mix lại PCR dùng hóa chất mới và chạy lại để xem cịn hiện tượng xảy ra nữa hay khơng. Nếu vẫn khơng quyết định được thì tốt nhất nên tách chiết lại hoặc lấy lại bệnh phẩm. Ngồi ra khi phải chạy nhiều mẫu thì các PXN thường

hay pha mix sẵn và để vào tủ âm, nếu bảo quản các mix pha sẵn này khơng tốt cũng sẽ có thể gặp dương tính giả vì thường các mix pha sẵn sẽ không được đậy chặt nắp mà chỉ đậy hờ nên dễ bị nhiễm. Do đó nên ghi ngày pha mix lên ống, để mix ở nơi tránh ánh sáng trong tủ, đồng thời pha xong nên dùng ngay trong vòng 3 - 5 ngày.

1.5. Ngoại nhiễm sản phẩm PCR, gây dương tính giả trong phịng xét

nghiệm Sinh học phân tử.

1.5.1. Vấn đề ngoại nhiễm sản phẩm PCR và khả năng phòng ngừa ngoại

nhiễm sản phẩm PCR của các bộ kít xét nghiệm SARS-CoV-2.

Nguyên lý của PCR là khuếch đại DNA, vì vậy các phịng thí nghiệm sử dụng PCR liên tục khơng sớm thì muộn cũng sẽ bị nhiễm sản phẩm PCR lên tất cả các thiết bị, dụng cụ, hóa chất. Người làm thí nghiệm sẽ nhận ra được thảm họa này khi toàn bộ các lần chạy PCR đều ra kết quả dương tính, kể cả khi sử dụng mẫu là nước cất. Khi điều này xảy ra thì chỉ có cách bỏ tồn bộ hóa chất, khử nhiễm tồn bộ phịng thí nghiệm… Dù vậy, điều này vẫn sẽ tái diễn sau một khoảng thời gian sử dụng PCR.

Hình 1.3: Sơ đồ xử lý sản phẩm PCR ngoại nhiễm bằng UNG

Nhiễm sản phẩm PCR từng là thách thức đối với các phịng thí nghiệm sinh học phân tử. Tuy nhiên, hiện nay các nhà khoa học đã có thể giải quyết vấn đề này một cách khá hữu hiệu, đó là trong thành phần dNTP có bổ sung thêm một ít dUTP. Các sản phẩm PCR tạo ra sẽ ln tồn tại một số vị trí là U thay vì T, các vị trí U này sẽ có thể xử lý phân hủy bằng enzme UNG. Mẫu DNA thu nhận từ mẫu thật (template) sẽ khơng chứa U, vì vậy ủ PCR mix với enzyme UNG trước khi chạy phản ứng PCR sẽ giúp phân cắt toàn bộ các DNA ngoại nhiễm mà không ảnh hưởng đến template.

1.5.2. Cách khử nhiễm và loại bỏ dương tính giả trong phản ứng PCR tại

Phản ứng PCR thường có độ nhạy rất cao, nhưng chính nhược điểm đó lại khiến kỹ thuật này dễ xảy ra dương tính giả. Trong phịng thí nghiệm, nơi chủ yếu thực hiện phản ứng PCR, bất kỳ sự dương tính giả nào cũng có thể thường xun xảy ra khơng

chỉ từ việc nhiễm sản phẩm khuếch đại. [54]

Một mao quản bị vỡ hay một khay PCR để bất cẩn ở mép bàn cũng đều khiến phát tán các phân tử sản phẩm khuếch đại. Và sau đó sản phẩm này sẽ ln hiện lên trong bất kỳ phản ứng PCR nào mà bạn thực hiện. Một cách đơn giản mà hiệu quả để loại bỏ việc nhiễm các sản phẩm khuếch đại là lau sạch tất cả mọi thứ, từ thiết bị, khu vực làm PCR đến pipet với chất tẩy (như Giaven,…).

Sodium hypochlorite là một thành phần có trong thuốc tẩy, được biết đến vào năm 1992 với tác dụng bảo vệ hiệu quả, chống lại sự nhiễm sản phẩm DNA khuếch đại bằng cách gây ra “extensive nicking”, do đó có khả năng ngăn chặn các đoạn kích thước 600

bp - sản phẩm của phản ứng PCR. [55]

Hiệu quả của thuốc tẩy trong việc khử nhiễm DNA phụ thuộc vào lượng clo tự do có trong thuốc tẩy đó. 0,05-0,5% clo tự do được coi là mức độ khử trùng trung bình và một chất tẩy thương mại (như Clorox) sẽ chứa khoảng 5.84% clo, do vậy việc pha loãng

thuốc tẩy 10-100 lần từ nồng độ gốc sẽ cho hiệu quả tốt. [55]

Cách thức và thời gian khử nhiễm:

- Cách thức: Phun/ xịt khu vực làm PCR/ thiết bị với 10% thuốc tẩy, sau đó để yên trong 15-30 phút. Tiếp theo lau sạch thuốc tẩy bằng nước sạch. Vì thuốc tẩy có tính ăn mịn mạnh, nên nó sẽ phá hủy vật liệu nếu không được loại bỏ kỹ với nước sạch.

- Thời gian: Quy trình lau rửa này nên được thực hiện trước và sau mỗi lần làm PCR. Bạn có thể lên lịch vệ sinh các thiết bị và khu vực làm PCR hàng tuần, đây cũng là một cách rất hữu hiệu để ngăn chặn việc nhiễm trong phản ứng PCR.

Những điểm quan trọng về việc pha loãng và bảo quản thuốc tẩy: + Dùng nước sạch để pha loãng thuốc tẩy;

+ Nên pha loãng thuốc tẩy thường xuyên: Hiệu quả của thuốc tẩy sẽ giảm theo thời gian, vì vậy, việc pha lỗng thuốc tẩy fresh (tươi) là điều rất cần thiết. Nếu không ngửi thấy mùi clo trong thuốc tẩy, thì đã đến lúc cần pha lỗng lại chúng, thường thì bảo quản dung dịch thuốc tẩy pha loãng (1:10) trong khoảng 1-2 tuần.

+ Pha lỗng ở nhiệt độ phịng trong dụng cụ đục màu (tránh ánh sáng), vì nhiệt độ, ánh sáng và oxy có thể góp phần làm phân hủy thuốc tẩy.

+ Khi thao tác với thuốc tẩy, cần đảm bảo các nguyên tắc an toàn như: mặc áo blouse, đeo găng tay, kính an tồn, khẩu trang,..

1.6. Sự tương tác của các thành phần trong máu đối với phản ứng PCR.

Hiện nay, trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, người ta đã phát hiện ra một số hóa chất có thể ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng này.

Bảng 1.1: Các chất ức chế phản ứng PCR

STT Các chất ức chế PCR Nguồn gốc

1 Heparin Máu:

+ Nội sinh: Tế bào mastocyte + Ngoại sinh: Ống chứa heparin

2 Hemoglobin Máu

3 Heme Máu

4 Lactoferrin Máu, sữa, thuốc tăng cường

hệ miễn dịch, thuốc thảo dược,..

5 Immunoglobin G ( IgG) Máu

Những chất ức chế PCR có thể ảnh hưởng đến tốc độ hoặc gây nhiễu phản ứng bằng cách gắn trực tiếp vào DNA/ RNA đích, làm mất hoạt tính enzym DNA polymerase

Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng ức chế phản ứng PCR của các chất.

Việc phát hiện và loại trừ các chất ức chế phản ứng PCR có tác dụng quyết định sự thành cơng và chất lượng của phản ứng PCR. Vì vậy, đây là một việc làm vơ cùng cần thiết đối với những người thực hiện phản ứng này.

Có thể phát hiện các chất ức chế PCR bằng cách sử dụng các chứng nội tại internal positive control (IPC) được cung cấp kèm theo bộ Kit của nhà sản xuất. Các số liệu thu được của phản ứng Real-time PCR cũng có thể được sử dụng để phát hiện các chất ức chế bằng cách phân tích hiệu quả khuếch đại của mẫu.

Việc phát hiện và khắc phục ảnh hưởng của các chất ức chế phản ứng PCR cho phép các phịng thí nghiệm sinh học phân tử lựa chọn tốt các mẫu hơn, thu được tỷ lệ khuếch đại thành công cao hơn và hiệu quả của phịng thí nghiệm được cải thiện hơn.

[56]

1.7. Giới thiệu về 2 bộ kít xét nghiệm chuẩn đốn SARS-CoV-2 do Việt Nam

sản xuất

Trên thế giới, các bộ kit do WHO công bố được sử dụng rộng rãi và cho độ chính xác cao. Tuy nhiên, giá thành các bộ kit này khá cao (trên 1 triệu đồng). Với lượng lớn mẫu cần được xét nghiệm mỗi ngày, chi phí cho các bộ kit xét nghiệm này là một gánh nặng không nhỏ cho hệ thống y tế công, và hiện chỉ được sử dụng ở Việt Nam như một test khẳng định. Do đó, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã tiến hành nghiên cứu phát triển các kit sàng lọc nhanh COVID-19. Có 2 bộ kit do Việt Nam sản xuất đã được Bộ Y tế cấp phép sử dụng trong các phòng xét nghiệm COVID-19 đó là:

+ Hai là bộ kít của Cơng ty cổ phần Sao Thái Dương sản xuất đã được Bộ Y tế Việt Nam cấp số lưu hành vào ngày 7/5/2020. Bộ kit là kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ Viện Kiểm định Quốc gia Vaccine và sinh phẩm y tế và Đại học Bách khoa Hà Nội, sau đó chuyển giao cơng nghệ cho công ty cổ phần Sao Thái Dương.

Cả 2 bộ kit đều đã được tiến hành thử nghiệm lâm sàng trước khi được đưa vào sử dụng. Dưới đây là một vài công bố của các nhà sản xuất bộ kit:

- Bộ kit của Việt Á này đã được Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đánh giá về: độ nhạy (xác định ngưỡng phát hiện tối thiểu thông qua số bản copy của virus SARS-CoV- 2); độ đặc hiệu (xác định phản ứng chéo của sinh phẩm với các virus gây viêm đường hô hấp cấp: SARS-CoV, Cúm A/H1pdm09, A/H3, A/H5, B và các mẫu âm tính khác); độ ổn định (xác định tính tương thích của sinh phẩm với các hệ thống máy Realtime PCR: ABI-7500 fast, Lifecycle (Roche), CFX-96 (Biorad), Rotorgen (Qiagen)). Các thử nghiệm đánh giá được lặp lại 3 lần/ bộ sinh phẩm. Kết quả đánh giá bước đầu cho thấy, 5 bộ test kit của Học viện Quân y có độ nhạy ổn định sau 3 lần lặp lại, có thể phát hiện

SARS-CoV-2 (với 5 bản copy).[57]

- Bộ kit của Sao Thái Dương đã tiến hành đánh giá thử nghiệm lâm sàng trên các bệnh phẩm tại Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương và Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương, bộ kit phát hiện được SAR-COV-2 trên các bệnh phẩm này. Bộ sinh phẩm đã được đánh giá trên 166 mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Giảm thời gian trả lời kết quả 2h; Độ đặc hiệu phân tích 100%; khơng có phản ứng chéo với 40 tác nhân gây viêm đường hơ hấp, Độ chính xác cao 100% với cv tái lặp <5%; Khơng có nhiễm chéo (Cross contamination) khi thử nghiệm trên panel mẫu dương nồng độ cao và mẫu âm; Độ đặc

hiệu lâm sàng 100% (95%CI: 97-100%). [58]

1.7.1. Bộ kít LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR của Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á phần Công nghệ Việt Á

a) Nguyên lý tách chiết

Bộ kít Việt Á sử dụng dung mơi hữu cơ cho việc tách chiết và thu hồi RNA. [59]

Dung dịch ly giải tế bào sẽ giúp phá vỡ màng tế bào và màng bào quan để giải phóng RNA và các chất nội bào khác. Trong khi đó việc sử dụng các dung môi hữu cơ như phenol-chloroform sẽ phân tách RNA khi ly tâm. Phenol: chloroform: isoamyl alcohol, bằng cách ly tâm, tạo thành ba lớp, bao gồm lớp hữu cơ bên dưới, lớp ở giữa chứa

protein-DNA, và lớp nước chứa RNA phía trên. Pha nước phía trên được thu thập, sau đó tiến hành kết tủa, rửa sạch và hịa tan trong nước khơng có RNase để thu được RNA tổng từ mẫu. Phương pháp phân tách và thu hồi axit nucleic dựa trên dung môi hữu cơ sử dụng phenol, chloroform và isoamyl alcohol được coi là phương pháp tiêu chuẩn vàng và năng suất cao.