lưu mẫu tại phòng xét nghiệm Sinh học phân tử thuộc Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Quảng Nam.
- 2 Bộ Kit xét nghiệm chuẩn đoán SARS- CoV- 2:
+ Bộ kít LightPower iVA SARS-CoV-2 1st RT-rPCR của Công ty cổ phần Công nghệ Việt Á.
+ Bộ kít One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai Duong của cơng ty cổ phần Sao Thái Dương.
+ Bộ kit đối chứng là bộ sinh phẩm xét nghiệm được WHO khuyến cáo sử dụng bao gồm những thành phần trong bảng sau:
So sánh Ct và CV của 2 bộ kít
Khảo sát sự thay đổi chu kỳ ngưỡng khi gộp mẫu
Kiểm tra sự tương tác của phản ứng PCR do nhiễm mẫu máu
2 bộ kít xét nghiệm xét nghiệm chuẩn đoán SARS-CoV-2
Đánh giá sơ bộ 2 bộ kít (quy trình, thời gian, chi phí…)
Đánh giá khả năng phịng ngừa ngoại nhiễm sản phẩm PCR
Đánh giá 2 bộ kít
Bảng 2.1: Sinh phẩm xét nghiệm khẳng định SARS-Cov-2 được khuyến cáo bởi Tổ chức y tế thế giới
STT Tên sinh phẩm- hóa chất Hãng sản
xuất
Quy cách
đóng gói Đơn vị tính
01 Sinh phẩm tách chiết RNA
bằng phương pháp cột QIAGEN 250test/ hộp Hộp
02 SuperScript TM III Platinum TM One-Step qRT-PCR Kit Invitrogen/ Thermo Fisher Scientific 500test/ hộp Hộp 03 E Assay_First Line Screening, 1000 Rxn IDT 1000test/ ống Ống 04 RdRP Assay_Discriminatory, 1000 Rxn IDT 1000test/ ống Ống 05 UltraPure TM Dnase/Rnase-
Free Distilled Water
Invitrogen/ Thermo
Fisher Scientific
500ml/ Chai Chai
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
Thiết bị được sử dụng phục vụ cho suốt quá trình nghiên cứu là bao gồm các thiết bị hiện đang có tại phịng Xét nghiệm Sinh học phân tử- Trung tâm Kiểm soát bệnh tật tỉnh Quảng Nam, cụ thể như sau:
+ Hệ thống xét nghiệm Real-Time RT-PCR tự động: hãng sản xuất: Agilent- Malaysia, Model: AriaDx K8930-64001;
+ Máy ly tâm tốc độ cao: Hãng sản xuất: Hettich- Đức, Model: Mikro 185; + Máy ly tâm mini: Hãng sản xuất: Hermle- Đức, Model: Z130M;
+ Tủ an toàn sinh học cấp II: Hãng sản xuất: Esco-Singapore, Model: SC2-4E1; + Tủ lạnh Inventer: Hãng sản xuất: Panasonic-Trung Quốc, Model: NR- NL340PVN;
+ Dụng cụ: Bao gồm micropipet các loại và các dụng cụ cần thiết khác.
Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu cơ bản trong việc lấy mẫu, bảo quản mẫu, gộp mẫu và xét nghiệm mẫu bằng phản ứng Realtime RT- PCR nhằm phát hiện virus SARS- CoV- 2 được Bộ Y tế quy định. Cụ thể như sau:
2.3.1. Xét nghiệm mẫu bằng phản ứng Realtime RT- PCR
2.3.1.1. Quy trình xét nghiệm SARS- CoV- 2 bằng bộ kít LightPower iVA
SARS-CoV-2 1st RT-rPCR của Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á.
Bộ LightPower iVASARS-CoV-2 1stRT-rPCR Kit (VA.A02-055G) của Việt Á là
kit định tính SARS-CoV-2 virus trong mẫu bệnh phẩm đường hơ hấp trên (hỗn hợp dịch mũi họng, dịch súc họng), đường hô hấp dưới (đờm, dịch phế nang, dịch nội khí quản, dịch màng phổi…) và mẫu máu bằng kỹ thuật real-time RT- PCR sử dụng TaqMan
probe. Các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất [59], được trình bày cụ thể như
sau:
Tiến hành xét nghiệm
❖ Tách chiết RNA:
- Đánh dấu các tube 1.5ml biopure bằng ký hiệu mẫu.
- Hút 200µl mẫu vào 1 tube biopure đã có sẵn 900µl dung dịch pER1, vortex 30s, để yên 10 phút.
- Thêm vào 200µl dung dịch pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tube phải chuyển thành màu trắng đục. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Thu 600µl dịch nổi có chứa RNA vào 1 tube biopure đã có sẵn 600µl dung dịch pEX3. Trộn đều, để yên 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu hồng (hoặc xanh). Cho từ từ 900µl dung dịch EX4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút.
- Loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 60oC trong 10 - 15 phút.
- Cho vào 50µl dung dịch ER5. Trước khi sử dụng, dùng pipet trộn đều cho đến khi phần cặn tan hoàn toàn.
- Bảo quản mẫu RNA ở -200C. Muốn lưu trữ lâu phải bảo quản ở -70oC .
❖ Thực hiện phản ứng real-time RT-PCR:
- Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
bước tiếp theo.
- Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.
- Nếu máy real-time PCR đọc từ đáy của tube: Viết kí hiệu mẫu trên nắp hoặc trên thân phần gần sát nắp. Nếu máy real-time PCR đọc từ đáy của tube: Viết kí hiệu mẫu trên thân phần thân sát nắp.
- Cho 5µl dịch RNA từ tách chiết hoặc chứng dương vào từng iVASARS-CoV-2
1stRT- rPCR Mix. Phải kiểm tra chắc chắn phần dịch trong tip phải được cho hết vào tube.
Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. Thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR (nhớ ly tâm).
- Bật máy real-time PCR, nhất là đèn của đầu đọc real-time ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình. Bật máy tính và chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương trình real- time PCR lên. Phải kiểm tra chắc chắn máy real-time PCR và máy tính đã kết nối với nhau.
- Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
- Với mẫu: Chọn loại mẫu là “Unknown”. Đặt tên hoặc số tương ứng với ký hiệu mẫu.
- Với chứng dương và âm: chọn “PTC-Possitive Control” và “NTC – Negative Control” đặt tên “Chứng dương”, “Chứng âm” tương ứng.
- Màu “FAM”, TEXAS RED và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm. - Màu “FAM”: Phát hiện trình tự mục tiêu SARS-CoV-2. Màu “TEXAS RED”: Phát hiện trình tự mục tiêu SARS-like coronaviruses. Màu “HEX”: Phát hiện trình tự chứng nội. - Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động theo chu trình nhiệt:
Bước
Nhiệt độ (oC) Thời gian
(phút:giây)
Số chu kỳ
Phiên mã ngược (RT) 50oC 10:00 1
Bất hoạt RT/hoạt hóa Taq 95oC 5:00 1
PCR
Biến tính 95oC 00:15
45
Gắn mồi, probe và kéo dài 55oC 00:45*
*: Thu tín hiệu huỳnh quang
- Lưu file dữ liệu vào máy tính.
- Cho máy real-time PCR chạy chương trình. - Kết thúc chương trình chạy, mở nắp, lấy rotor ra. - In kết quả và tắt máy.
- Ghi nhật ký sử dụng thiết bị.