- Chứng âm, chứng dương, và chứng nội phải có trong mỗi lần chạy.
- Nếu chứng không đạt, tất cả mẫu và chứng từ lần chạy đó phải được thực hiện lại từ bước xử lí mẫu.
2.3.1.2. Quy trình xét nghiệm SARS- CoV- 2 bằng bộ kít One-step RT-PCR COVID-19 Kit Thai Duong của công ty cổ phần Sao Thái Dương COVID-19 Kit Thai Duong của công ty cổ phần Sao Thái Dương
Các bước tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất [60a], được trình bày cụ thể như
sau:
Tiến hành xét nghiệm
❖ Tách chiết RNA:
+ Hồn ngun 310µl Bufer AVE vào ống Carier RNA(*);
+ Cho thêm 5,6 µl (*) vào ống tube 1,5ml + 560 µl Buffer AVL (**);
+ Cho thêm 140 (200) µl mẫu vào. Voxtex, ly tâm, Ủ nhiệt độ phịng 10 phút; + Cho thêm 560 µl cồn tuyệt đối (ethanol), Voxtex, ly tâm (***);
+ Chuẩn bị cột lọc (trong bộ kit); hút 630 µl (***) cho vào cột lọc, ly tâm 8000 vòng/ 1 phút;
+ Thay cột lọc qua ống góp 1, lọc tiếp 630 µl cịn lại, ly tâm 8000 vịng/ 1 phút; + Thay cột lọc qua ống góp 2, cho 500 µl nước rửa 1, ly tâm 8000 vòng/ 1 phút;
+ Thay cột lọc qua ống góp 3, ho 500 µl nước rửa 2, ly tâm 14000 vòng/ 4 phút; + Thay cột lọc qua ống Tube 1,5ml (lưu ý: Lấy nhẹ không để nước rửa chạm vào cột lọc);
+ Cho 60 µl AVE vào giữa cột lọc (tránh chạm đầu côn vào miếng lọc), để yên 1 phút. Ly tâm 8000 vòng/ 1 phút;
+ Bỏ cột lọc- thu được RNA; + Cho 5 µl RNA vào MIX đã pha.
❖ Thực hiện phản ứng real-time RT-PCR:
Các bước thực hiện phản ứng giống với quy trình của bộ kít Việt Á như trên. Tuy nhiên có sự thay đổi về chu trình nhiệt:
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt chạy bằng kit Sao Thái Dương
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian
(phút:giây)
Số chu kỳ
Phiên mã ngược (RT) 50oC 30:00 1
Bất hoạt RT/hoạt hóa Taq 95oC 15:00 1
PCR
Biến tính 95oC 00:20
45
Gắn mồi, probe và kéo dài 60oC 00:40*
*: Thu tín hiệu huỳnh quang
Giữ ở nhiệt độ 4oC ∞
2.3.2. Phương pháp biện luận kết quả
Mẫu dương tính khi có đường khuyếch đại dạng log và linear, máy hiển thị giá trị ct (<40).
Mẫu âm tính khi khơng có đường khuyếch đại, máy không hiển thị giá trị ct mà hiển thị: non detectable.
Mẫu nghi ngờ khi có đường khuyếch đại rất muộn, không rõ ràng (giá trị ct>40). Đối với những mẫu này cần lặp lại xét nghiệm.
Hình 2.2: Đọc kết quả phản ứng PCR
Yêu cầu đối với các chứng:
– Chứng dương: Dương tính (có đường khuyếch đại log, linear, ct <35).
– Chứng âm và chứng mock: Âm tính (khơng có đường khuyếch đại, ct: non
detectable).
– Chứng nội RNP: Dương tính (có đường khuyếch đại log, linear, ct <38).
2.3.3. Phương pháp gây nhiễm trong việc đánh giá khả năng phòng ngừa ngoại nhiễm sản phẩm PCR của 2 bộ kit ngoại nhiễm sản phẩm PCR của 2 bộ kit
Phương pháp gây nhiễm loại 01:
- Sử dụng type có chứa mẫu là sản phẩm sau khi chạy phản ứng Real time RT- PCR cho kết quả dương tính với virus SARS-CoV-2 (c-DNA);
- Tiến hành gây nhiễm bằng cách hút 20µl mẫu c-DNA cho vào ống chứa 1000µl mẫu bệnh phẩm âm tính với virus SARS-CoV-2;
- Tiến hành tách chiết và chạy phản ứng Real time RT- PCR như một mẫu bệnh bệnh phẩm bình thường theo các quy trình ở Sơ đồ 2.2 và 2.3. Lặp lại 3 lần đối với mỗi loại sinh phẩm.
Phương pháp gây nhiễm loại 02: