- Bộ kít Sao Thái Dương: Thời gian tách chiết RNA nhanh hơn nhiều so với sử
3.2. So sánh chu kỳ ngưỡng (Ct) và CV trên cùng một mẫu dương tính được chuẩn bị từ 2 bộ kit.
chuẩn bị từ 2 bộ kit.
Ct value (threshold cycle value) được gọi là giá trị chu kỳ ngưỡng. Ct là chu kỳ nhiệt mà ở tại một thời điểm thiết bị Real-time RT-PCR bắt đầu ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng PCR vượt qua cường độ huỳnh quang nền, hay là số chu kỳ máy phải chạy để phát hiện được tín hiệu huỳnh quang từ mẫu bệnh phẩm. Dựa vào chu kỳ ngưỡng (Ct) để đánh giá nồng độ virus có trong mẫu bệnh phẩm. Ct value tỷ lệ nghịch với nồng độ virus bởi mẫu càng nhiều virus SARS-CoV-2 thì tín hiệu huỳnh quang sẽ xuất hiện sớm ở những chu kỳ đầu tiên (Ct nhỏ), và ngược lại mẫu càng ít virus SARS-CoV-2 thì tín hiệu huỳnh quang sẽ xuất hiện muộn ở những chu kỳ lớn (Ct lớn). Theo hướng dẫn đọc kết quả của 2 bộ kít thì mẫu dương tính khi có đường khuyếch đại dạng log và linear, máy hiển thị giá trị Ct<40); mẫu âm tính khi khơng có đường khuyếch đại, máy khơng hiển thị giá trị ct mà hiển thị “non detectable”; mẫu nghi ngờ khi có đường khuyếch đại rất muộn, khơng rõ ràng (giá trị Ct>40). Đối với những mẫu này cần lặp lại xét nghiệm.
Từ phân tích ở trên cho thấy, giá trị về độ chụm (precision) của 2 bộ kit chưa được công bố rộng rãi. Để so sánh sự khác biệt trong chu kỳ ngưỡng (Ct) khi thực hiện xét nghiệm cùng một mẫu bệnh phẩm bằng 2 bộ kít của Việt Á và của Sao Thái Dương, cũng như độ ổn định (độ chụm) của 2 bộ kit xét nghiệm, chúng tôi đã tiến hành đánh giá trên cùng một mẫu đã được ghi nhận là các ca dương tính bằng cả các test kiểm nghiệm và triệu chứng lâm sàng. Đối với từng bộ kít, mỗi mẫu được thực hiện lặp lại 3 lần một cách độc lập nhằm đánh giá độ ổn định của 2 bộ kit (thông qua chỉ số về hệ số biến thiên, coefficient of variation (CV)). Trong đó, kit WHO được sử dụng như bộ kit đối sánh.
Hiện chúng tơi chưa tìm thấy quy định cụ thể nào về số lượng mẫu cần dùng cho việc đánh giá các chỉ tiêu về Ct và CV cho các bộ kit xét nghiệm bằng phương pháp RT- PCR. Tuy nhiên, theo quy trình thẩm định các phương pháp định lượng trong hóa học và vi sinh vật, số mẫu thường dùng trong mỗi phịng thí nghiệm là 10, và tiến hành đánh
giá ở nhiều phịng thí nghiệm khác nhau [67] . Ở đây, do giới hạn về tài chính và số lượng
kit Việt Á hạn chế (bộ kit đã ngừng sản xuất), chúng tơi chỉ có thể thực hiện trên 6 mẫu dương tính, với số lần lặp lại độc lập cho mỗi mẫu là 3 lần. Vì vậy số lượng kết quả thu được là tương đối lớn phù hợp để tiến hành các phân tích thống kê so sánh giữa 2 bộ kit. Kết quả chạy trên hệ thống RT-PCR được trình bày trong hình 3.1-3.4 và bảng PL1.1.
1- 3 đường biểu diễn mẫu 1 được thực hiện lặp lại 3 lần (kênh màu FAM) 2- 3 đường biểu diễn mẫu 2 được thực hiện lặp lại 3 lần (kênh màu FAM) 3- 3 đường biểu diễn mẫu 3 được thực hiện lặp lại 3 lần (kênh màu FAM)
Hình 3.1: Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR của 3 mẫu thử nghiệm bằng bộ kít Việt Á
1- 3 đường biểu diễn mẫu 1 được chạy được thực hiện lặp lại 3 lần (kênh màu HEX)