- Bộ kít Sao Thái Dương: Thời gian tách chiết RNA nhanh hơn nhiều so với sử
2 -3 đường biểu diễn mẫu được chạy được thực hiện lặp lại 3 lần (kênh màu HEX)
3.3. Đánh giá khả năng phòng ngừa ngoại nhiễm sản phẩm PCR củ a2 bộ kit
Các kết quả trên một lần nữa cho thấy các bộ kit của Việt Nam sản xuất là phù hợp để sử dụng cho việc phát hiện Covid-19. Tuy nhiên để đánh giá toàn diện hơn về hiệu
năng sử dụng của 2 bộ kit, chúng tôi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo về khả năng phòng ngừa ngoại nhiễm các sản phẩm PCR của 2 bộ kit.
Dương tính giả do nhiễm các sản phẩm của quá trình PCR vào mẫu xét nghiệm là một vấn đề lớn trong chuẩn đoán phân tử, khuếch đại DNA hoặc bất cứ ứng dụng nào yêu cầu khuếch đại cùng một loại gen. Một giải pháp phổ biến là sử dụng phương pháp tiếp cận uracil-DNA glycosylase (UDG) hoặc uracil-N-glycosylase (UNG) -dUTP để chống lại sự nhiễm bẩn từ các sản phẩm khuếch đại. Phương pháp này được giới thiệu
bởi Longo et al. [68], và các xét nghiệm chẩn đốn thương mại sử dụng hệ thống này hiện
có sẵn [69]. Phương pháp này liên quan đến việc thay thế dUTP cho dTTP trong tất cả
các PCR để đảm bảo rằng tất cả DNA phát sinh từ các quá trình khuếch đại này sẽ chứa dUTP. Vì UDG khơng hoạt động trên DNA, dUTP, UTP hoặc RNA chứa dT, nên việc khuếch đại RNA hoặc DNA mục tiêu tự nhiên không bị ảnh hưởng. Nếu tất cả các sản phẩm khuếch đại có chứa dUTP, các chất gây ơ nhiễm có thể được loại bỏ trước khi khuếch đại mà không cần mở lại ống để thêm polymerase hoặc khuôn mẫu.
Hầu hết các kit phát hiện SARS-CoV-2 được chấp thuận và phát triển bởi WHO
đều có sử dụng hệ thống UDG-dUTP để phòng trừ ngoại nhiễm sản phẩm [70] . Tuy
nhiên, 2 bộ kit của Việt Nam khơng có cơng bố về việc sử dụng hệ thống này. Vì vậy chúng tơi đã thiết kế thí nghiệm để kiểm tra khả năng phịng trừ ngoại nhiễm sản phẩm của 2 bộ kít bằng 2 cách là gây nhiễm sản phẩm từ phản ứng RT-PCR dương tính vào mẫu âm tính (1) và gây nhiễm mẫu âm tính với mẫu tách chiết RNA từ 2 bộ kít (2).
Đối với phương pháp gây nhiễm loại 01:
Mẫu gây nhiễm là sản phẩm từ phản ứng RT-PCR cho kết quả dương tính với virus SARS-CoV-2 ở Ct 20,32.
Các mẫu thử nghiệm cho kết quả như bảng sau:
Bảng 3.3: Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR đối với mẫu gây nhiễm loại 1
LẦN 1 LẦN 2 LẦN 3
VIỆT Á >40 >40 >40
Đối với phương pháp gây nhiễm loại 02:
Mẫu gây nhiễm RNA ban đầu cho kết quả dương tính với virus SARS-CoV-2 ở Ct 20,32.
Các mẫu thử nghiệm cho kết quả như bảng sau:
Bảng 3.4: Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR đối với mẫu gây nhiễm loại 2
LẦN 1 LẦN 2 LẦN 3
VIỆT Á 23.15 24.98 24.41
SAO THÁI DƯƠNG 24.52 25.36 24.16
Hình 3.5: Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR lặp lại 3 lần đối với mẫu gây nhiễm loại 2 bằng bộ kít Việt Á.
Hình 3.6: Kết quả chạy phản ứng Realtime RT-PCR lặp lại 3 lần đối với mẫu gây nhiễm loại 2 bằng bộ kít Sao Thái Dương.
Dựa vào kết quả nhận được từ việc chạy phản ứng Realtime RT-PCR đối với các mẫu được gây nhiễm bởi các phương pháp gây nhiễm khác nhau ta nhận thấy:
- Đối với phương pháp gây nhiễm loại 01: Mẫu gây nhiễm là sản phẩm của quá trình khuếch đại gen bằng phản ứng Realtime RT-PCR khơng có khả năng lây nhiễm chéo và cho kết quả dương tính cho các mẫu khác khi thực hiện xét nghiệm bằng 2 bộ kít của Việt Á và Sao Thái Dương. Hay có thể nhận xét rằng Kít xét nghiệm của Việt Á và Sao Thái Dương có thể phịng ngừa ngoại nhiễm đối với sản phẩm khuếch đại này.
- Đối với phương pháp gây nhiễm loại 02: Mẫu gây nhiễm là RNA của virus SARS- CoV-2 sau khi tách chiết và gây nhiễm trở lại thì sau khi chạy phản ứng Realtime RT- PCR đều cho kết quả dương tính.
Từ kết quả trên cho thấy, việc tách riêng hai khu vực tách chiết RNA và khu vực mix mẫu cho phản ứng PCR, cũng như việc chun mơn hóa các khâu bằng các cán bộ phụ trách khác nhau là cần thiết. Trước đây, do nhiều hạn chế, các khu vực cịn chưa có sự tách bạch rõ ràng, thường mang tính liên tục giữa 2 khu. Thêm vào đó, do hạn chế về mặt nhân lực nhân viên xét nghiệm thường sẽ chịu trách nhiệm cho toàn bộ các khâu trong kiểm nghiệm. Điều này rất dễ dẫn tới tình trạng lây nhiễm chéo, gây sai lệch kết quả.
Kết quả trên lần nữa cho thấy, các đường chạy từ mẫu được phân tích từ Việt Á thường cho kết quả đẹp hơn mẫu được phân tích từ kit Sao Thái Dương. Điều này có thể được giải thích là Sao Thái Dương phân tích trên cả 2 vùng gen là N1 và N2, so với chỉ 1 vùng gen đích như ở kit Việt Á. Đây là một ưu điểm của kit Việt Á, giúp cho việc xác định threshold dễ dàng hơn. Cũng vì vậy, giá trị Ct được xác định bởi kit chạy Sao Thái Dương thường lớn hơn so với kit Việt Á. Việc sử dụng 4 kênh màu là (FAM, HEX, ROX và Cy5) có những vùng phát xạ (emission) trùng nhau gây ảnh hưởng tới việc thu nhận kết quả như được thể hiện ở phụ lục 4. Vì vậy, địi hỏi cán bộ kỹ thuật có kinh nghiệm trong việc hiệu chỉnh và cân bằng các kênh màu để loại trừ việc thu nhận các tín hiệu lẫn phát ra từ những kênh không mong muốn, tránh ảnh hưởng tới việc đọc kết quả và ghi nhận kết quả bị sai lệch.