PHẦN 1 : TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.4.Phương pháp nghiên cứu
Giống cấp I là các ống thạch nghiêng được cấy từ các giống nấm đã phân lập từ thể quả nấm. Môi trường để nhân giống cấp I là môi trường thạch nghiêng.
* Phương pháp làm môi trường thạch đĩa, thạch nghiêng (môi trường thạch - đường - khoai tây)
Môi trường thạch đĩa và thạch nghiêng là môi trường giàu inh ư ng được làm từ nguyên liệu gồm đường glucozơ, thạch agar, nước vô trùng.
- Khoai tây: 200g - Đường glucoza: 20g - Thạch agar: 20g - 1 l t nước vô trùng
hoai tây gọt vỏ, cắt nhỏ k ch thước 1cm x1cm, đun sôi đến khi khoai tây ch n kỹ từ 5 - 7 phút rồi lọc, sau đó cho thêm thạch và đường, bổ sung nước cho đủ 1 l t rồi đun cho tan hết thạch.
Để làm môi trường thạch nghiêng sử ụng môi trường thạch đã đun chảy cho vào phễu nối với ống cao su có gắn kẹp sắt. Ấn kẹp sắt cho môi trường chảy vào đáy ống nghiệm, nên đổ khoảng 1/5 so với chi u ài ống nghiệm sau đó lấy bơng nút ống nghiệm sau đó đóng thành từng bó rồi đem khử trùng ở nồi hấp ở nhiệt độ 110o
C, 1atm trong vòng 60 phút khử trùng xong để thẳng đứng cho hơi nước bay hết rồi đặt nghiêng trên một que g . Đợi thạch đơng, bó lại để vào tủ ấm 37oC trong một ngày, nếu ống nào b nhiễm khuẩn phải loại bỏ. Thạch nghiêng dùng để giữ giống, để nhân giống cấp I.
* Tạo giống cấp 1: Thực hiện khử trùng các ụng cụ cấy, ùng que cấy
chia b mặt sợi nấm thành từng miếng nhỏ sau đó chuyển sang ống thạch nghiêng mới, ùng bông khử trùng nút miệng ống nghiệm lại.
* Nuôi giống cấp 1: Sau khi cấy giống đưa các ống nghiệm vào trong tủ
ấm có nhiệt độ từ 20 - 25oC, loại bỏ những ống b nhiễm nấm lạ, đợi đến khi sợi nấm ăn hết b mặt thạch th ùng để nhân giống cấp II.
* Bố trí thí nghiệm: th nghiệm được tiến hành trên 1 ống gốc * Các chỉ tiêu theo dõi:
- Động thái tăng trưởng của hệ sợi nấm (cm/2 ngày) - Tốc độ ăn lan của sợi nấm (cm/2 ngày)
- Thời gian sinh trưởng: Được t nh từ lúc cấy đến khi hệ sợi nấm ăn lan hết b mặt thạch để đem nhân giống cấp II.
- So sánh tốc độ ăn lan và thời gian sinh trưởng của các loại nấm
2.4.2. Nhân giống cấp II
Giống cấp II là giống được cấy trong các chai thuỷ tinh hay các túi chất ẻo có miệng là ống nhựa có nút bằng bơng m . Giống cấp II có thể chế tạo bằng nhi u công thức nhưng đ u phải là môi trư ng xốp với nguyên liệu ch nh là ngũ cốc, cám, mùn cưa.
- Mơi trường này bao gồm: thóc được ngâm trong nước trong khoảng từ 12 - 16 tiếng để loại bỏ hạt lép.
- Tiến hành luộc thóc: Cho thóc vào nồi rồi đổ nước ngập thóc, đun sơi ùng đũa đảo đ u đến khi hạt thóc nứt 1/3 vỏ thóc, gạo bên trong ch n m m là được, đổ thóc ra để ráo nước và nguội.
Sau đó tiến hành trộn bột nhẹ CaCO3 theo tỉ lệ 10kg thóc trộn 200g bột nhẹ, trộn đ u phủ đ u lớp bột trên hạt thóc luộc là được.
- Tiến hành đóng gói mơi trường cấp II vào chai thuỷ tinh: Cho nguyên liệu trên vào chai thuỷ tinh bằng 2/3 chai sau đó nút bơng, sau đó khử trùng trong 1 giờ ở áp lực 1atm nhiệt độ 121o
C. Đợi nguội rồi cấy các giống cấp I vào đó.
- ỹ thuật cấy truy n: Giống cấp I đạt tiêu chuẩn cấy sang giống cấp II đến khi hệ sợi nấm ăn lan đ u khắp b mặt thạch là được.
- Nuôi sợi nấm giống cấp II: Để chai thuỷ tinh có giống cấp II sang tủ ấm nhiệt độ từ 20 - 25oC, loại bỏ những chai b nhiễm nấm lạ.
* Bố trí thí nghiệm: Được tiến hành trên 5 ống thạch nghiêng giống cấp I
và 10 chai giống cấp II.
* Các chỉ tiêu theo dõi:
- Động thái tăng trưởng của hệ sợi nấm (cm/2 ngày) - Tốc độ ăn lan của sợi nấm (cm/2 ngày)
- Thời gian sinh trưởng: thời gian sinh trưởng của giống cấp II tính từ ngày cấy đến khi hệ sợi nấm ăn lan đ u khắp trong môi trường chai giống.
- So sánh tốc độ ăn lan và thời gian sinh trưởng của các loại nấm ùng để nhân giống.
2.4.3. Nhân giống cấp III (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giống cấp III được nhân truy n từ giống cấp II trên môi trường inh ưõng tương tự giống cấp II nhưng với số lượng lớn hơn và chai thuỷ tinh được thay bằng túi P.E ch u nhiệt.
Quy trình làm mơi trường giống cấp III giống như môi trường làm giống cấp II. Sau khi trộn thóc và bột nhẹ theo tỉ lệ 200g/ 10kg ta đóng mơi trường vào các túi P.E ch u nhiệt m i túi 0,5 kg, làm cổ túi bằng nút bông và nắp lại bằng nắp nhựa tránh khi hấp làm ướt nút bông. Đem hấp trong 120 phút ở nhiệt độ 121oC áp suất 1atm. Hấp xong đưa vào ph ng cấy, bật đèn UV để khử trùng phịng cấy và các túi mơi trường cấp III.
Giống cấp II đạt tiêu chuẩn khi hệ sợi nấm ăn lan đ u b mặt môi trường nuôi cấy và có màu trắng sữa. Từ một chai cấp II cấy truy n sang giống cấp III với tỉ lệ 1/20.
- ỹ thuật cấy truy n: Mở miệng nút bông chai giống cấp II và mở túi bông ở túi giống cấp III dùng que cấy cấy các sợi nấm ở giống cấp II sang, cấy xong hơ nút bông và nút túi giống cấp III lại. Làm tương tự đối với các túi giống khác đến khi hết chai giống cấp II.
- Nuôi sợi giống nấm cấp III: Chuyển các túi nấm cấp III vào tủ ấm có nhiệt độ từ 20 - 25o
C, theo õi sự phát triển của hệ sợi nấm, loại bỏ những túi b nấm lạ.
* Bố trí thí nghiệm: Giai đoạn nhân giống cấp III với 3 chai giống cấp II
với tỉ lệ 1/20 chọn những chai có hệ sợi nấm lan nhanh.
* Các chỉ tiêu theo dõi:
- Thời gian sinh trưởng của ngẫu nhiên 10 túi giống cấp III từ giống cấp II nhân sang.
- Tỉ lệ nhiễm bệnh = số túi b bệnh / tổng số túi sản xuất.
2.4.4. Phương pháp xử lí số liệu